Summary
Denne protokollen beskriver genereringen av en hudfascia utviset kalt "SCar like tissue in A Dish" eller SCAD. Denne modellen tillater enestående visualisering av enkle fibroblaster under arrdannelse.
Abstract
Pattedyrets globale respons på tetting av dype vevssår er gjennom arrdannelse og vevskontraksjon, mediert av spesialiserte fasciafibroblaster. Til tross for den kliniske betydningen av arrdannelse og nedsatt sårheling, er vår forståelse av fascia fibroblastdynamikk i sårheling kortfattet på grunn av mangel på relevante analyser som muliggjør direkte visualisering av fibroblastkoreografi og dynamikk i komplekse miljøer som i hudsår. Dette papiret presenterer en protokoll for å generere ex-situ hud arr ved hjelp av SCAD eller "SCar-lignende vev i en tallerken" som etterligner det komplekse miljøet av hudsår. I denne analysen utskilles 2 mm hud med full tykkelse og dyrkes opp ned i media i 5 dager, hvor arr og hudkontrakturer utvikler seg jevnt. Denne metodikken, kombinert med fibroblast-avledningsspesifikke transgene musemodeller, muliggjør visualisering av individuelle fibroblastavledninger over hele sårreparasjonsprosessen. Samlet sett hjelper denne protokollen forskere med å forstå grunnleggende prosesser og mekanismer for sårreparasjon, og utforsker direkte effekten av modulatorer på sårhelingsresultater.
Introduction
Sårheling er en prosess for restaurering av brutte sår. Vevsskader hos hvirvelløse dyr resulterer i delvis eller fullstendig regenerering. I motsetning reagerer pattedyr på dyp skade ved arrdannelse, en prosess skreddersydd for raskt å forsegle sår med tette plugger av matrisefibre som minimerer det brutte området og samtidig permanent deformerer det skadede stedet 1,2,3. Store hudforbrenninger eller dype åpne sår hos pattedyr resulterer i patologiske fenotyper som hypertrofiske eller keloid arr 4,5. Disse sprudlende arrene forårsaker en enorm byrde på kliniske og globale helsesystemer. Bare i USA koster arrhåndtering rundt 10 milliarder dollar årlig 6,7. Derfor er utviklingen av relevante metoder nødvendig for å bedre forstå de fundementale prosessene og mekanismene som er involvert i arrdannelse.
I de senere år har et bredt spekter av studier på mus avslørt heterogene fibroblastpopulasjoner med distinkte funksjonelle potenser basert på deres opprinnelse på visse hudsteder 8,9,10. I bakhuden identifiserte Rinkevich et al., 2015, at en bestemt fibroblastpopulasjon med et tidlig embryonalt uttrykk for Engrailed-1 (En1), kalt EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrar til kutan arrdannelse ved såring. Motsatt bidrar en annen fibroblast avledning uten historie med innfelt uttrykk, Innfelt negativ fibroblast (ENF), ikke til arrdannelse8. Skjebnekartlegging av disse En1-linjene ved hjelp av Cre-drevne transgene muselinjer krysset til fluorescensreportermuselinjer som R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) tillater visualisering av EPF- og ENF-populasjoner.
Å studere fibroblast migrasjon in vivo over flere dager er begrenset av etiske og tekniske begrensninger. Videre er sammensatte, virale og nøytraliserende antistoffbibliotekskjermer for å modulere veier involvert i arrdannelse teknisk utfordrende. Tidligere brukte in vitro- eller ex vivo-modeller mangler evnen til å visualisere fibroblastmigrasjon og arrdannelse i ekte hudmikromiljøer, ensartethet i arrutvikling, samt vevskompleksitet som emulerer in vivo hudmiljøer11,12. For å overvinne de ovennevnte begrensningene utviklet vi en ex vivo scarring analyse kalt SCAD (SCar-lignende vev i A Dish)13,14. Denne enkle analysen kan utføres ved å utskille 2 mm fulltykkelseshud som inneholder epidermis, dermis og de subkutane fasciaområdene og dyrke dem i serum-supplerte DMSO-medier i opptil 5 dager. Arr generert fra SCAD gjenskaper pålitelig transkripsjons- og proteomiske kjennetegn på in vivo arr. I tillegg kan SCADer generert fra relevante transgene muselinjer (f.eks. En1-mus) krysset med fluorescerende reportermuslinjer tillate visualisering av fibroblast migrasjonsdynamikk og arrutvikling med en enestående oppløsning. Videre kan denne modellen enkelt tilpasses for alle bruksområder med høy gjennomstrømning (f.eks. sammensatt bibliotek, antistoffbibliotek eller viral screening)13,14. I denne artikkelen beskriver vi en optimalisert protokoll for å generere SCADs og påfølgende nedstrøms prosesseringsprogrammer for å studere cellulær og matrisedynamikk i arrutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Modellen som presenteres nedenfor gir en detaljert trinnvis beskrivelse av generasjonen av SCAD-analyse som kort beskrevet i Jiang et al., 202013. SCAD prøveforberedelser ble utført etter å ha ofret dyrene i henhold til internasjonale og regjeringen i Øvre Bayern retningslinjer. Dyr ble plassert på dyreanlegget til Helmholtz Centre Munich. Rommene ble opprettholdt med optimal fuktighet og konstant temperatur med en 12 timers lyssyklus. Dyr ble forsynt med mat og vann ad libitum.
1. SCAD vev forberedelse
- Ofre nyfødte valper påpostnatal dag 0 eller dag 1 (P0 eller P1).
- Slukk forsiktig minst 1,5 cm x 1,5 cm rygghud i full tykkelse til skjelettmuskulaturlaget ved hjelp av en steril kirurgisk skalpell.
- Skrell huden ved hjelp av sterile buede tang, og sørg for at den overfladiske fascia er intakt med den underliggende panniculus carnosus muskelen.
- Vask det utskilte vevet med 50-100 ml kaldt DMEM/F-12-medium for å fjerne forurensende blod.
- Vask én gang med Hanks' balanserte saltløsning (HBSS) for å opprettholde vev og celle levedyktighet.
- Legg huden opp ned (overfladisk fascia på toppen) i en 10 cm Petri-tallerken som inneholder DMEM/F12-medier.
- Ved hjelp av en engangs 2 mm biopsi punch, excise full tykkelse runde hudstykker, sikre at overfladisk fascia er intakt med underliggende panniculus carnosus muskel til epidermis å generere SCAD vev.
- Forbered og fyll 200 μL DMEM/F12 (uten fenolrød) komplette medier-DMEM/F12-medier supplert med 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM ikke-essensielle aminosyrer og 1x Penicillin/streptomycin i individuelle brønner på en 96-brønns plate.
- Bruk sterile tang, overfør forsiktig og senk det enkelte SCAD-vevet opp ned (fascia vendt opp) til brønnene på en 96-brønnsplate.
- Overfør platen til en cellekulturinkubator som vedlikeholdes under standardforhold (37 °C, 21 %(v/v) oksygen, 5 % (v/v) C02 og 95 % fuktighet).
2. SCAD - Vev kultur
- Kultur SCADs i en inkubator i opptil 5 dager.
- På dag 2 og dag 4 av kulturen, erstatt media med 200μl frisk forvarmet DMEM / F12 komplette medier for å sikre fortsatte celle- og vev levedyktighetsforhold. Bytt ut behandlingsforbindelser under hver medieendring.
MERK: Sørg for å la 10 μL medier ligge i brønnen for å unngå at vev fester seg til brønnene. - Forbered SCADer for følgende eksperimenter: Levende avbildning (avsnitt 3) og vevshøsting og 2D/3D-immunfluorescensfarging (avsnitt 4).
3. Live bildebehandling av SCADs
- Forbered minst 30 ml 2%-3% (w / v) lav smeltende agarose løsning i PBS i en glassflaske ved å varme den opp i en mikrobølgeovn til koking.
- Overfør straks flasken og avkjøl den flytende agaroseoppløsningen i et 40 °C vannbad.
- Overfør SCAD-vevet med fascia/Arr vendt oppover til midten av en 35 mm tallerken.
- Bygg inn SCAD ved romtemperatur (RT) ved å sakte overføre 40 °C væske på 35 mm-parabolen ved hjelp av en Pasteur-pipette. Agarose polymeriserer innen 2 min.
- Tilsett 2 ml forvarmede DMEM/F12 komplette medier (uten fenolrød indikator).
- Skaff deg tidsforløp Bilder av dag 0 SCADs opptil 48 timer ved hjelp av et konfokalt eller et multifotonmikroskop utstyrt med et passende inkubasjonssystem satt til 37 °C, 21 % (v/v) oksygen, 5 % (v/v) C02 og 95 % fuktighet.
4. Vevshøsting og 2D/3D-immunfluorescensfarging
- Vask vevet på relevante tidspunkter ved å erstatte mediet med steril PBS.
- Bruk sterile tang, overfør forsiktig individuelle SCADer til 1,5 ml mikrosenterfugerør som inneholder 500 μL 2% paraformaldehyd for å fikse vevet over natten ved 4 °C.
- Vask vevet tre ganger med PBS og fortsett med 2D/3D immunfluorescensfarging.
- 3D-immunfluorescensfarging
- Permeabiliser vevet ved å inkubere i et 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder 500 μL PBS supplert med 0,2% gelatin, 0,5% Triton-X100 og 0,01% Thimerosal (PBSGT) ved RT i 24 timer.
- Forbered en tilstrekkelig mengde primære antistoffer i henhold til produsentens instruksjoner og inkuber SCAD vev i 150 μL PBSGT-løsning i 24 timer ved RT.
MERK: Hvis den optimale antistoffkonsentrasjonen for immunfluorescens ikke rapporteres av produsenten, må tidligere antistofftitrering utføres på kontrollvev ved hjelp av varierende konsentrasjoner (f.eks. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Vask SCADene forsiktig tre ganger med PBS for å fjerne det ubundne primære antistoffet.
- Inkuber vev med 1:1000 relevante Alexa Fluor sekundære antistoffer i PBS over natten på RT.
- Vask vevet forsiktig i 30 min i PBS tre ganger for å fjerne overflødige ubundne sekundære antistoffer.
- Overfør vevet til en 35 mm glassbunnsfat for konfokal eller flerfotonavbildning.
MERK: Når du bruker mål for vanninnlevelse, legger du inn SCADene i 2 % lavt smeltepunkt for å immobilisere vevet for å forhindre drift under bildeanskaffelse
- 2D-immunfluorescensfarging
- Overfør vevet til en kryoform og fyll forsiktig med optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse for å fullstendig nedsenke vevet.
- Juster forsiktig vevets orientering, og sørg for fravær av luftbobler for å oppnå et tverrsnitt eller et vertikalt avsnitt.
- Legg formen på tørris i 20-30 min og inkuber blokken ved -80 °C over natten.
- Sett bladtemperaturen til -25 °C og prøveblokktemperaturen til -17 °C. Forbered 6 μm kryo-seksjon ved hjelp av en kryostat, overfør seksjonene til en vedheftssklie, og oppbevar lysbildene i -20 °C fryser.
- Skyll lysbildene tre ganger i PBS og inkuber lysbildene i 5% Bovine Serum Albumin (BSA) m/v i PBST (PBS supplert med 0,05% Tween) i 1 time.
- Tilsett en passende mengde primært antistoff til 150μl PGST, og inkuber over natten ved 4 °C
MERK: Hvis den optimale antistoffkonsentrasjonen for immunfluorescens ikke rapporteres av produsenten, må tidligere antistofftitrering utføres på kontrollseksjoner ved hjelp av varierende konsentrasjoner (f.eks. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Vask seksjonene forsiktig tre ganger med PBS for å fjerne det ubundne primære antistoffet.
- Inkuber vev med 1:1000 relevante Alexa Fluor sekundære antistoffer i PBS over natten på RT i 2 timer.
- Vask vevet forsiktig i 5 min i PBS tre ganger for å fjerne overflødige ubundne sekundære antistoffer.
- Monter lysbildene med et monteringsmedium som inneholder DAPI, og tørk lysbildene i mørket ved RT.
- Bilde seksjonene ved hjelp av et fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av SCADs kan deles inn i tre viktige trinn: Høsting av tilbake hud fra P0-P1 mus, generering av biopsislag i full tykkelse og påfølgende kultur av individuelle scads opptil 5 dager i 96-brønnsplater. Som en avlesning kan denne analysen videre brukes til å analysere de romlige og tidsmessige aspektene ved arrdannelse. Den romlige analysen benytter 2D og 3D immunmerking av vev for å studere romlig lokalisering av cellulære og matrisekomponenter innen utvikling av arrvev. Romlige studier tillater visualisering av disse eks-situ arrene ved hjelp av vev iboende eller ekstrinsiske fluorescerende proteiner som kan visualiseres ved hjelp av relevante 3D-tidsforløp avbildningsmodaliteter.
De avgjørende trinnene i denne analysen setter opp eksperimentet ved å nøye generere biopsislag i full tykkelse, sikre tilstedeværelsen av et fascial "gelé" -lag, og dyrke vevet helt nedsenket opp ned (epidermis vendt mot bunnen av 96-brønnsplatene). Dette gjør det mulig å utvikle ensartede arr, sammenlignbar migrasjonsdynamikk i relevante fibroblastpopulasjoner og hudkontraksjon på tvers av SCADs (figur 1A). Allsidigheten til SCAD-analysen gjør det mulig å høste vevet over hele spekteret av arrutvikling. For eksempel, hvis målet med eksperimentet er å studere den tidlige dynamikken i arrdannelse, kan romlig og romlig analyse begrenses til D1 eller D2 av SCAD-kultur (figur 1B).
Representative helmonterte lysfeltbilder av SCADer på dag 0 og dag 5 vises i henholdsvis figur 2A og figur 2A. For 2D-analyse er det viktig å legge inn SCADene i OCT i vinkelrett orientering uten luftbobler for å sikre intakt vev etter seksjonering. Disse vevsseksjonene kan videre bli utsatt for histologisk analyse (f.eks. Masson trichrome staining-Figure 2B,2B') eller Immunofluorescence staining (Figur 2C,2C') på kryoseksjonene fra En1 Cre,R26mTmG musedoseral dermis; EPF i grønt og ENF i rødt fra tidlig (figur 2D) og senfase arr (figur 2D').
3D- og 3D-tidsforløpavbildning av arr krever at fluorescenssignaler oppdages dypt inne i vevet (400-800 μm). Eksitasjon i nær-infrarøde bølgelengder ved hjelp av to-foton eksitasjon muliggjør slike målinger uten behov for vevsrydding, en metodikk som vanligvis brukes i 3D-avbildning for å gjøre vev gjennomsiktig ved å minimere lysspredning og absorpsjon 15,16,17. Vi brukte et oppreist Multiphoton mikroskop utstyrt med et 25x vanndippende mål i kombinasjon med en justerbar laser. Vev ble utsatt for 3D-immunfarging ved hjelp av relevante sonder. For 3D-avbildning ble vevet innebygd i en 2% lav smeltende agaroseløsning for å immobilisere eller forhindre drift i vev (figur 3A) toppet med PBSGT for å matche brytningsindeksen som kreves for vann nedsenkningsmålet. Representativt bilde i figur 3B og figur 3B' viser eksklusiv lokalisering av N-Cadherin-protein (rosa/magenta-Alexa fluor 647) på arrstedet til en dag 5 SCAD fra en En1 Cre,R26mTmG rygghud; EPF i grønt, og ENF i rødt. For 3D-tidsforløpavbildning ble det gjort en liten modifikasjon av oppsettet ovenfor ved å legge inn vevet i en 2% lav smeltende agaroseløsning toppet med DMEM / F12-medier uten fenolrød indikator i stedet for PBS. For å sikre riktige forhold for "levende" SCAD-vev under avbildning, ble det tilsatt et passende inkubasjonskammer slik at alle fenotyper registreres riktig under avbildning (figur 3C). Representative øyeblikksbilder av tidlige fibroblastsvermer er vist i figur 3D, figur 3D' og figur 3D'' i løpet av de første 12 timer / tidlige stadiene av arrutvikling.
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt for SCAD-analyse. (A) Tilbake hud fra barseldag 0 / dag 1 valper utskilles, noe som sikrer vevsintegriteten som inneholder følgende dermale lag: Epidermis (E), papillære og retikulære dermis (PD og RD), og Fascialag (F) etterfulgt av 2 mm biopsislag for å oppnå dag 0 SCADs. (B) SCADs kan deretter dyrkes i opptil 5 dager med et valgfritt periodisk høst / vevsfikseringstrinn basert på arten av individuelle eksperimenter (stiplede piler) med et kulturmedieendringstrinn på dag 2 og dag 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 2D-immunfluorescensfarging. Representative 2D-avlesninger for å studere tidlige og sene arr ved hjelp av (A og A') Bright field helmontert bilde på dag 0 (A) og dag 5 (A'). (B og B') Massons trichrome farging av vertikale vev seksjoner for å avsløre signaturer av vev arr-vev sammentrekning og akkumulering av ECM ved arrkjernen (gul fylt trekant) på dag 0 (B) og dag 5 (B'). (C og C') Immunfluorescence analyse av dag 0 (C) og dag 5 (C') SCADs generert fra En1Cre, R26mTmG rygghud. EPFer vises i grønt, ENF i rødt og DAPI i blått fra tidlig (D) og sen stadium (D') arr. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk oppsett og representativ avlesning av SCADs for 3D-romlig og romlig analyse. (A) Skjematisk fremstilling av innbygging av SCADene i 2% lav smeltetemperatur agarose gel under et oppreist fluorescerende mikroskop og (B) representativt bilde av en 3D-immunofluorescentscent dag 5 SCAD generert fra En1 Cre,R26mTmG musdermis og immunfarget med N-Cadherin antistoff (Magenta). EPFer vises i grønt, og ENF-er vises i rødt. (C) Skjematisk representasjon 3D-bildebehandling SCAD-oppsett utstyrt med et inkubasjonskammer: 37 °C, 21 % (v/v) oksygen, 5 % (v/v) C02 og 95 % fuktighet. (D) Representative resultater av live bildebehandling som viser tidlige hendelser av progresjon av fibroblast svermer (hvit stiplet sirkel) i de første 12 h av dag 0 og dag 1 stadium SCAD. (E) Grafisk fremstilling av encellede sporede cellulære baner av individuelle fibroblaster ved D, D' og D''. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere modeller er allerede utviklet for å forstå arrdannelse etter skade. Mens mange fremskritt har blitt gjengitt i denne forbindelse, men, er faktiske mekanismer fortsatt ikke klare. I motsetning til den forrige teknikken inkorporerer SCAD-modellen alle celletyper og kutane lag, og opprettholder dermed kompleksiteten i innfødt hud18,19. Denne metodikken er i stand til å generere grunnleggende datasett som er viktige for å forstå molekylære mekanismer som driver arrdannelse. Analysen er utformet på en måte som er enkel, minimalistisk, men likevel i stand til å produsere grunnleggende og funksjonelle avlesninger som er avgjørende for å forstå fibroblastmigrasjon, ECM-avsetning, epidermal / muskelkontraksjon13,14. Det er relativt mindre komplekst enn in vivo-oppsett, og avvik med hensyn til prøven kan minimeres. Videre kan denne analysen enkelt kombineres med rørledninger med høy gjennomstrømningsanalyse. Hvor hele spekteret eller bibliotekene av inhibitorer eller aktivatorer som kjemiske forbindelser, nøytraliserende antistoffer, siRNA eller virale metoder som reduserer eller fremmer arrdannelse, kan brukes med relativt letthet til minimale mengder eksisert vev. Når det gjelder begrensningen av denne ex vivo arrmodellen, kan denne analysen ikke brukes til å studere fenotypiske eller dynamiske aspekter av a) ikke-bosatte immunsvermer i arrutvikling b) vaskularisering c) arrmodning da vev ikke er levedyktig utover 5 dager etter skade.
Før biopsi slår eksisjon, er det viktig at det ikke må være gjenværende blod igjen i vevet, da det kan forstyrre prosessen med eksperimentet. Vi anbefaler å vaske vevet mer enn en gang med HBSS om nødvendig, for å sikre at gjenværende blod fra vevet elimineres. Også skiftende medier på alternative dager må utføres med spesiell forsiktighet, da de dermale og epidermale lagene kan skille seg på grunn av vevets lille størrelse. Derfor er det viktig å øve prosedyren riktig på forhånd før du starter faktiske eksperimenter. For å unngå gjentatt separasjon av vevslagene, foreslår vi at under medieendring kan 10 μl gjenværende medier holdes før de erstattes med friske medier for å stabilisere vevet og minimere endringen i overflatespenningen på vevet forårsaket av mediet som legges til brønnen.
For 2D-analyserørledninger anbefaler vi å likevekte vevet med flytende optimal skjæretemperaturforbindelse ved romtemperatur i noen minutter før du monterer vevet i en blokk. Dette forhindrer vevsseparasjon på grunn av iskrystalldannelse under seksjonering. 3D/3D-tidsforløp i bilderørledninger bør endres tilstrekkelig basert på tilgjengelig mikroskopmodalitet. For et oppreist mikroskop (med eller uten vanninnlevelsesmål), innebygging av vevet i agarose eller bruk av superlim forhindrer fysisk skift av vev under avbildning. Mål for vanninnlevelse tillater 3D/3D-tidsforløpavbildning ved hjelp av PBS eller fargeløse medier (uten fenolrød). For et invertert mikroskop kan vev plasseres på en glassbunn/bildeplate og immobiliseres ved hjelp av en dråpe lav smeltetemperatur og toppes med egnede medier for å sikre levedyktighet under levende bildebehandling. I begge modaliteter kan et kompatibelt inkubasjonssystem brukes til å sikre riktig temperatur, fuktighet og gassforsyning under avbildning.
Til slutt muliggjør SCAD-modellen identifisering og karakterisering av nye molekylære signaler og mekanistiske veier involvert i pattedyr sårheling 13,14. Protokollen gir en detaljert beskrivelse av generering av SCADs og potensielle nedstrøms applikasjoner og analyse for å gi innsikt i arrutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi anerkjenner alle medforfatterne av Jiang et al. 2020 for å bidra til utviklingen av SCAD-metodikk13. Vi takker Dr. Steffen Dietzel og Bioimaging kjerneanlegg på Ludwig-Maximilans-Universität for tilgang til Multiphoton-systemet. Y.R. ble støttet av Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) og LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
References
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
