Summary
Detta protokoll beskriver genereringen av en hudfascia explantad som kallas "SCar som vävnad i en maträtt" eller SCAD. Denna modell möjliggör oöverträffad visualisering av enstaka fibroblaster under ärrbildning.
Abstract
Däggdjurets globala svar på tätning av djupa vävnadssår är genom ärrbildning och vävnadskontraktion, medierad av specialiserade fasciafibroblaster. Trots den kliniska betydelsen av ärrbildning och nedsatt sårläkning är vår förståelse av fasciafibroblastdynamik vid sårläkning kortfattad på grund av bristen på relevanta analyser som möjliggör direkt visualisering av fibroblastkoreografi och dynamik i komplexa miljöer som i hudsår. Detta dokument presenterar ett protokoll för att generera ex- situ hudärr med SCAD eller "SCar-liknande vävnad i en maträtt" som efterliknar den komplexa miljön av hudsår. I denna analys skärs 2 mm hud i full tjocklek ut och odlas upp och ner i media i 5 dagar, under vilka ärr och hudkontrakturer utvecklas enhetligt. Denna metodik, i kombination med fibroblast-härstamningsspecifika transgena musmodeller, möjliggör visualisering av enskilda fibroblastlinjer över hela sårreparationsprocessen. Sammantaget hjälper detta protokoll forskare att förstå grundläggande processer och mekanismer för sårreparation, direkt utforska effekterna av modulatorer på sårläkningsresultat.
Introduction
Sårläkning är en process för restaurering av brutna sår. Vävnadsskador hos ryggradslösa djur resulterar i partiell eller fullständig regenerering. Däremot svarar däggdjur på djup skada genom ärrbildning, en process skräddarsydd för att snabbt täta sår med täta pluggar av matrisfibrer som minimerar det brutna området och samtidigt permanent deformerar det skadade stället 1,2,3. Stora hudbrännskador eller djupa öppna sår hos däggdjur resulterar i patologiska fenotyper som hypertrofiska eller keloidärr 4,5. Dessa sprudlande ärr orsakar en enorm börda för kliniska och globala sjukvårdssystem. Bara i USA kostar ärrhantering cirka 10 miljarder dollar årligen 6,7. Därför krävs utveckling av relevanta metoder för att bättre förstå de fundementala processer och mekanismer som är involverade i ärrbildning.
Under de senaste åren har ett brett spektrum av studier på möss avslöjat heterogena fibroblastpopulationer med distinkta funktionella potenser baserat på deras ursprung på vissa hudplatser 8,9,10. I bakhuden identifierade Rinkevich et al., 2015, att en specifik fibroblastpopulation med ett tidigt embryonalt uttryck av Engrailed-1 (En1), kallad EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrar till kutan ärrbildning vid sårbildning. Omvänt bidrar en annan fibroblastlinje utan historia av insnärjt uttryck, Engrailed negative fibroblast (ENF), inte till ärrbildning8. Ödeskartläggning av dessa En1-linjer med hjälp av Cre-drivna transgena muslinjer korsade till fluorescensreportermuslinjer som R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) möjliggör visualisering av EPF- och ENF-populationer.
Att studera fibroblastmigration in vivo under flera dagar begränsas av etiska och tekniska begränsningar. Dessutom är sammansatta, virala och neutraliserande antikroppsbiblioteksskärmar för att modulera vägar som är involverade i ärrbildning tekniskt utmanande. Tidigare använda in vitro- eller ex vivo-modeller saknar förmågan att visualisera fibroblastmigration och ärrbildning i äkta hudmikromiljöer, enhetlighet i ärrutveckling samt vävnadskomplexitet som emulerar in vivo hudmiljöer11,12. För att övervinna ovanstående begränsningar utvecklade vi en ex vivo ärrbildningsanalys som kallas SCAD (SCar-liknande vävnad i en maträtt)13,14. Denna enkla analys kan utföras genom att excitera 2 mm fullhudshud som innehåller epidermis, dermis och subkutan fascia och odla dem i serumkompletterade DMSO-medier i upp till 5 dagar. Ärr som genereras från SCAD replikerar på ett tillförlitligt sätt transkriptomiska och proteomiska kännetecken för in vivo-ärr. Dessutom möjliggör SCAD: er genererade från relevanta transgena muslinjer (t.ex. En1-möss) korsade med fluorescerande reportermuslinjer visualisering av fibroblastmigrationsdynamik och ärrutveckling med en aldrig tidigare skådad upplösning. Dessutom kan denna modell enkelt anpassas för alla applikationer med hög genomströmning (t.ex. sammansatt bibliotek, antikroppsbibliotek eller viral screening)13,14. I den här artikeln beskriver vi ett optimerat protokoll för att generera SCADs och efterföljande nedströms bearbetningsapplikationer för att studera cell- och matrisdynamik i ärrutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Modellen som presenteras nedan ger en detaljerad steg-för-steg-beskrivning av genereringen av SCAD-analys som kortfattat beskrivs i Jiang et al., 202013. SCAD-provberedningar utfördes efter att djuren offrats enligt de internationella och överbayerska regeringens riktlinjer. Djur inhystes på djuranläggningen i Helmholtzcentret i München. Rummen upprätthölls med optimal luftfuktighet och konstant temperatur med en 12 h ljuscykel. Djur försågs med mat och vatten ad libitum.
1. Beredning av SCAD-mjukpapper
- Offra nyfödda valpar påpostnatal dag 0 eller dag 1 (P0 eller P1).
- Skär försiktigt ut minst 1,5 cm x 1,5 cm rygghud i full tjocklek tills skelettmuskelskiktet med en steril kirurgisk skalpell.
- Skala huden med sterila böjda pincett, se till att den ytliga fascian är intakt med den underliggande panniculus carnosus muskeln.
- Tvätta den utskurna vävnaden med 50-100 ml kallt DMEM / F-12-media för att avlägsna förorenande blod.
- Tvätta en gång med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) för att bibehålla vävnads- och cellviabiliteten.
- Placera huden upp och ner (ytlig fascia ovanpå) i en 10 cm petriskål som innehåller DMEM/F12-media.
- Använd en engångs 2 mm biopsistans, skär ut runda hudbitar i full tjocklek, vilket säkerställer att ytlig fascia är intakt med underliggande panniculus carnosus-muskel tills epidermis genererar SCAD-vävnader.
- Förbered och fyll 200 μL DMEM / F12 (utan fenolrött) komplett media-DMEM / F12-media kompletterat med 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM icke-essentiella aminosyror och 1x Penicillin / streptomycin i enskilda brunnar på en 96-brunnsplatta.
- Använd sterila pincett, överför försiktigt och sänk ner individuell SCAD-vävnad upp och ner (fascia uppåt) till brunnarna på en 96-brunnsplatta.
- Överför plattan till en cellodlingsinkubator som upprätthålls under standardförhållanden (37 °C, 21 % (v/v) syre, 5 % (v/v) C02 och 95 % luftfuktighet).
2. SCAD - Vävnadsodling
- Kultur SCADs i en inkubator i upp till 5 dagar.
- På dag 2 och dag 4 av odlingen, ersätt mediet med 200 μl färska förvärmda DMEM / F12 kompletta medier för att säkerställa fortsatta cell- och vävnadsviabilitetsförhållanden. Byt ut behandlingsföreningar under varje mediebyte.
OBS: Se till att lämna 10 μL media i brunnen för att undvika att vävnader fastnar i brunnarna. - Förbered SCAD för följande experiment: Levande avbildning (avsnitt 3) och Vävnadsskörd och 2D / 3D immunofluorescensfärgning (avsnitt 4).
3. Levande avbildning av SCAD: er
- Förbered minst 30 ml 2%-3% (w/v) lågsmältande agaroslösning i PBS i en glasflaska genom att värma den i en mikrovågsugn tills den kokar.
- Överför omedelbart flaskan och kyl den flytande agaroslösningen i ett 40 °C vattenbad.
- Överför SCAD-mjukpapperet med fascia/ärr uppåt på mitten av en 35 mm skål.
- Bädda in SCAD vid rumstemperatur (RT) genom att långsamt överföra 40 °C flytande agaros till 35 mm skålen med en Pasteur-pipett. Agaros polymeriseras inom 2 min.
- Tillsätt 2 ml förvärmt komplett DMEM/F12-media (utan fenolröd indikator).
- Skaffa time-lapse-bilder av dag 0 SCADs upp till 48 timmar med hjälp av ett konfokalt eller ett multifotonmikroskop utrustat med ett lämpligt inkubationssystem inställt på 37 ° C, 21% (v / v) syre, 5% (v / v) C02 och 95% luftfuktighet.
4. Vävnadsskörd och 2D / 3D-immunofluorescensfärgning
- Tvätta vävnaderna vid relevanta tidpunkter genom att ersätta mediet med steril PBS.
- Använd sterila pincett, överför försiktigt enskilda SCAD till 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 500 μL 2% paraformaldehyd för att fixera vävnaderna över natten vid 4 °C.
- Tvätta vävnaderna tre gånger med PBS och fortsätt med 2D / 3D immunofluorescensfärgning.
- 3D-färgning av immunofluorescens
- Permeabilisera vävnaderna genom att inkubera i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 500 μL PBS kompletterat med 0,2% gelatin, 0,5% Triton-X100 och 0,01% Thimerosal (PBSGT) vid RT i 24 timmar.
- Förbered en tillräcklig mängd primära antikroppar enligt tillverkarens anvisningar och inkubera SCAD-vävnader i 150 μL PBSGT-lösning i 24 timmar vid RT.
OBS: Om den optimala antikroppskoncentrationen för immunfluorescens inte rapporteras av tillverkaren måste tidigare antikroppstitrering utföras på kontrollvävnader med varierande koncentrationer (t.ex. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Tvätta försiktigt SCAD: erna tre gånger med PBS för att ta bort den obundna primära antikroppen.
- Inkubera vävnad med 1: 1000 relevanta Alexa Fluor sekundära antikroppar i PBS över natten vid RT.
- Tvätta försiktigt vävnaden i 30 minuter i PBS tre gånger för att avlägsna överskott av obundna sekundära antikroppar.
- Överför vävnaden till en 35 mm glasskål för konfokal eller multifotonavbildning.
OBS: När du använder vattenbadsmål, bädda in SCAD: erna i 2% låg smältpunktsagaros för att immobilisera vävnaden för att förhindra drift under bildförvärv
- 2D-färgning av immunofluorescens
- Överför vävnaden till en kryoform och fyll försiktigt med optimal skärtemperatur (OCT) förening för att helt fördjupa vävnaden.
- Justera försiktigt vävnadens orientering, vilket säkerställer frånvaron av luftbubblor för att få ett tvärsnitt eller en vertikal sektion.
- Lägg formen på torris i 20-30 min och inkubera blocket vid -80 °C över natten.
- Ställ in bladtemperaturen på -25 °C och provblocktemperaturen på -17 °C. Förbered 6 μm kryosektion med en kryostat, överför sektionerna till en vidhäftningsglas och förvara objektglasen i frysen på -20 °C.
- Skölj objekten tre gånger i PBS och inkubera objektglasen i 5 % bovint serumalbumin (BSA) w/v i PBST (PBS kompletterat med 0,05 % tween) i 1 timme.
- Tillsätt en lämplig mängd primär antikropp till 150 μl PGST och inkubera över natten vid 4 °C
OBS: Om den optimala antikroppskoncentrationen för immunfluorescens inte rapporteras av tillverkaren måste tidigare antikroppstitrering utföras på kontrollsektioner med varierande koncentrationer (t.ex. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Tvätta försiktigt sektionerna tre gånger med PBS för att ta bort den obundna primära antikroppen.
- Inkubera vävnad med 1: 1000 relevanta Alexa Fluor sekundära antikroppar i PBS över natten vid RT i 2 timmar.
- Tvätta försiktigt vävnaden i 5 minuter i PBS tre gånger för att ta bort överskott av obundna sekundära antikroppar.
- Montera objektglasen med ett monteringsmedium som innehåller DAPI och torka objektglasen i mörker vid RT.
- Avbilda sektionerna med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av SCADs kan delas in i tre viktiga steg: Skörda tillbaka huden från P0-P1-möss, generera biopsistansar i full tjocklek och efterföljande odling av enskilda scads upp till 5 dagar i 96-brunnsplattor. Som en avläsning kan denna analys vidare tillämpas för att analysera de rumsliga och tidsmässiga aspekterna av ärrbildning. Den rumsliga analysen använder 2D- och 3D-immunmärkning av vävnader för att studera rumslig lokalisering av cellulära och matriskomponenter inom utvecklande ärrvävnad. Spatiotemporala studier möjliggör visualisering av dessa ex-situ-ärr med hjälp av vävnads inneboende eller extrinsiska fluorescerande proteiner som kan visualiseras med hjälp av relevanta 3D-time-lapse-avbildningsmetoder.
De avgörande stegen i denna analys är att ställa in experimentet genom att noggrant generera biopsistansar i full tjocklek, säkerställa närvaron av ett fascialt "gelé" -lager och odla vävnaden helt nedsänkt upp och ner (epidermis vänd mot botten av 96-brunnsplattorna). Detta möjliggör utveckling av enhetliga ärr, jämförbar migrationsdynamik hos relevanta fibroblastpopulationer och hudkontraktion över SCADs (Figur 1A). Mångsidigheten hos SCAD-analys gör det möjligt att skörda vävnaden över hela spektrumet av ärrutveckling. Till exempel, om syftet med experimentet är att studera den tidiga dynamiken i ärrbildning, kan rumslig och spatiotemporal analys begränsas till D1 eller D2 av SCAD-kultur (Figur 1B).
Representativa helmonterade ljusfältsbilder av SCAD: er vid dag 0 och dag 5 visas i figur 2A respektive figur 2A '. För 2D-analys är det viktigt att bädda in SCAD: erna i OCT i vinkelrät orientering utan luftbubblor för att säkerställa intakt vävnad efter sektionering. Dessa vävnadssektioner kan vidare utsättas för histologisk analys (t.ex. Masson trichrome staining-Figure 2B,2B') eller Immunofluorescensfärgning (Figur 2C,2C') på kryosektionerna från En1 Cre,R26mTmG mus dorsal dermis; EPF i grönt och ENF i rött från tidigt (figur 2D) och ärr i sent skede (figur 2D').
3D- och 3D-time-lapse-avbildning av ärr kräver att fluorescenssignaler detekteras djupt inne i vävnaden (400-800 μm). Excitation i nära infraröda våglängder med hjälp av tvåfoton excitation möjliggör sådana mätningar utan behov av vävnadsrensning, en metod som vanligtvis används vid 3D-avbildning för att göra vävnad transparent genom att minimera ljusspridning och absorption 15,16,17. Vi använde ett upprätt Multiphoton-mikroskop utrustat med ett 25x vattendoppningsmål i kombination med en avstämbar laser. Vävnader utsattes för 3D-immunfärgning med hjälp av relevanta sonder. För 3D-avbildning var vävnaden inbäddad i en 2% lågsmältande agaroslösning för att immobilisera eller förhindra drift i vävnad (figur 3A) toppad med PBSGT för att matcha det brytningsindex som krävs för vattenfördjupningsmålet. Representativ bild i figur 3B och figur 3B visar exklusiv lokalisering av N-Cadherin-protein (rosa / magenta-Alexa fluor 647) på ärrplatsen för en dag 5 SCAD från en En1Cre, R26mTmG bakhud; EPF i grönt och ENF i rött. För 3D-time-lapse-avbildning gjordes en liten modifiering av ovanstående inställning genom att bädda in vävnaden i en 2% lågsmältande agaroslösning toppad med DMEM / F12-media utan fenolröd indikator istället för PBS. För att säkerställa rätt förutsättningar för "levande" SCAD-vävnad under avbildning tillsattes en lämplig inkubationskammare så att alla fenotyper registreras korrekt under avbildning (figur 3C). Representativa ögonblicksbilder av tidiga fibroblastsvärmar visas i figur 3D, figur 3D 'och figur 3D'' under de första 12 timmarna/tidiga stadierna av ärrutveckling.
(A) Bakhud från postnatal dag 0 / dag 1 valpar skärs ut, vilket säkerställer vävnadsintegriteten som innehåller följande dermala lager: Epidermis (E), papillär och retikulär dermis (PD och RD) och Fascia-lager (F) följt av 2 mm biopsistansar för att erhålla dag 0 SCAD. (B) SCAD kan sedan odlas därefter i upp till 5 dagar med ett valfritt intermittent skörd / vävnadsfixeringssteg baserat på arten av enskilda experiment (prickade pilar) med ett förändringssteg för odlingsmedier på dag 2 och dag 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: 2D-immunofluorescensfärgning. Representativa 2D-avläsningar för att studera ärr i tidigt och sent skede med hjälp av (A och A') Ljusfält helmonterad bild vid dag 0 (A) och dag 5 (A '). (B och B') Massons trikroma färgning av vertikala vävnadssektioner för att avslöja signaturer av vävnadsärrbildning-vävnadskontraktion och ackumulering av ECM vid ärrkärnan (gulfylld triangel) vid dag 0 (B) och dag 5 (B'). (C och C') Immunofluorescensanalys av dag 0 (C) och dag 5 (C') SCADs genererade från En1 Cre,R26mTmG bakhud. EPF visas i grönt, ENF i rött och DAPI i blått från tidigt (D) och sent stadium (D') ärr. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk inställning och representativa avläsningar av SCAD: er för 3D-spatio och spatiotemporal analys. mus dermis och immunfärgad med N-Cadherin-antikropp (Magenta). EPF visas i grönt och ENF visas i rött. (C) Schematisk representation 3D-avbildning SCAD-inställning utrustad med en inkubationskammare: 37 ° C, 21% (v / v) syre, 5% (v / v) C02 och 95% luftfuktighet. (D) Representativa resultat av levande avbildning som visar tidiga händelser av progression av fibroblastsvärmar (vit streckad cirkel) under de första 12 timmarna av dag 0 och dag 1 steg SCAD. (E) Grafisk representation av encellsspårade cellulära banor för enskilda fibroblaster vid D, D 'och D''. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera modeller har redan utvecklats för att förstå ärrbildning efter skada. Även om många framsteg har gjorts i detta avseende, men de faktiska mekanismerna är fortfarande inte tydliga. Till skillnad från den tidigare tekniken innehåller SCAD-modellen alla celltyper och kutana lager, vilket bibehåller komplexiteten hos den ursprungliga huden18,19. Denna metod kan generera grundläggande datamängder som är viktiga för att förstå molekylära mekanismer som driver ärrbildning. Analysen är utformad på ett sätt som är enkelt, minimalistiskt, men ändå kapabelt att producera grundläggande och funktionella avläsningar som är avgörande för att förstå fibroblastmigration, ECM-deposition, epidermal / muskelkontraktion13,14. Det är relativt mindre komplext än in vivo-inställningar, och avvikelser med avseende på provet kan minimeras. Dessutom kan den här analysen enkelt kopplas till analyspipelines med högt dataflöde. Med detta hela spektrumet eller biblioteken av hämmare eller aktivatorer såsom kemiska föreningar, neutraliserande antikroppar, siRNA eller virala metoder som minskar eller främjar ärrbildning kan tillämpas relativt enkelt på minimala mängder utskurna vävnader. När det gäller begränsningen av denna ex vivo-ärrmodell kan denna analys inte tillämpas för att studera fenotypiska eller dynamiska aspekter av a) icke-bosatta immunsvärmar i ärrutveckling b) vaskularisering c) ärrmognad eftersom vävnad inte är livskraftig längre än 5 dagar efter skada.
Innan biopsi slår excision är det viktigt att det inte får finnas något kvarvarande blod kvar i vävnaden eftersom det kan störa experimentets förfaranden. Vi rekommenderar att du tvättar vävnaden mer än en gång med HBSS vid behov, för att se till att eventuellt kvarvarande blod från vävnaden elimineras. Byte av media på alternativa dagar måste också utföras med särskild försiktighet, eftersom de dermala och epidermala skikten kan separera på grund av vävnadens lilla storlek. Därför är det absolut nödvändigt att öva proceduren ordentligt i förväg innan du startar faktiska experiment. För att undvika upprepad separering av vävnadsskikten föreslår vi att under medieförändring kan 10 μl kvarvarande media hållas innan de ersätts med färska medier för att stabilisera vävnaden och minimera förändringen i ytspänning på vävnaden orsakad av mediet som läggs till brunnen.
För 2D-analysledningar rekommenderar vi att du likställer vävnaden med flytande optimal skärtemperaturförening vid rumstemperatur i några minuter innan vävnaden monteras i ett block. Detta förhindrar vävnadsseparation på grund av iskristallbildning under sektionering. 3D/ 3D-tidsfördröjningsavbildningsrörledningar bör modifieras på lämpligt sätt baserat på den tillgängliga mikroskopmodaliteten. För ett upprätt mikroskop (med eller utan vatten nedsänkningsmål) förhindrar inbäddning av vävnaden i agaros eller användning av superlim den fysiska förskjutningen av vävnad under avbildning. Vattenbadsmål möjliggör 3D / 3D-tidsfördröjningsavbildning med PBS eller färglösa medier (utan fenolrött). För ett inverterat mikroskop kan vävnad placeras på en glasbotten / bildplatta och immobiliseras med en droppe agaros med låg smälttemperatur och toppas med lämpliga medier för att säkerställa livskraft under levande avbildning. I båda metoderna kan ett kompatibelt inkubationssystem användas för att säkerställa rätt temperatur, fuktighet och gastillförsel under avbildning.
Sammanfattningsvis möjliggör SCAD-modellen identifiering och karakterisering av nya molekylära ledtrådar och mekanistiska vägar som är involverade i sårläkning hos däggdjur13,14. Protokollet ger en detaljerad beskrivning av genereringen av SCADs och potentiella nedströmsapplikationer och analys för att ge insikt i ärrutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner alla medförfattare till Jiang et al.2020 för att ha bidragit till utvecklingen av SCAD-metodik13. Vi tackar Dr. Steffen Dietzel och Bioimaging-kärnanläggningen vid Ludwig-Maximilans-Universität för tillgång till Multiphoton-systemet. Y.R. stöddes av Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) och LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
References
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
