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Biology

ScAD परख का उपयोग कर निशान विकास visualizing - एक पूर्व सीटू त्वचा Scarring परख

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63808
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Institute of Regenerative Biology and Medicine, Helmholtz Zentrum München, 2School of Medicine, Klinikum Rechts der Isar, Department of Plastic and Hand Surgery, Technical University of Munich

Summary

यह प्रोटोकॉल एक त्वचा-प्रावरणी स्पष्टीकरण की पीढ़ी का वर्णन करता है जिसे "एक डिश में ऊतक की तरह स्कार" या एससीएडी कहा जाता है। यह मॉडल निशान गठन के दौरान एकल फाइब्रोब्लास्ट के अभूतपूर्व विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।

Abstract

गहरे ऊतक घावों को सील करने के लिए स्तनधारी वैश्विक प्रतिक्रिया निशान गठन और ऊतक संकुचन के माध्यम से होती है, जो विशेष प्रावरणी फाइब्रोब्लास्ट्स द्वारा मध्यस्थता की जाती है। निशान गठन और बिगड़ा घाव भरने के नैदानिक महत्व के बावजूद, घाव भरने में प्रावरणी फाइब्रोब्लास्ट गतिशीलता की हमारी समझ प्रासंगिक assays की कमी के कारण सरसरी है जो त्वचा के घावों जैसे जटिल वातावरण में फाइब्रोब्लास्ट कोरियोग्राफी और गतिशीलता के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करती है। यह पेपर एससीएडी या "एक डिश में स्कार-जैसे ऊतक" का उपयोग करके पूर्व-सीटू त्वचा के निशान उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो त्वचा के घावों के जटिल वातावरण का अनुकरण करता है। इस परख में, 2 मिमी पूर्ण मोटाई त्वचा excised और 5 दिनों के लिए मीडिया में उल्टा नीचे सुसंस्कृत है, जिसके दौरान निशान और त्वचा contractures समान रूप से विकसित. यह पद्धति, फाइब्रोब्लास्ट-वंश विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के साथ युग्मित, पूरे घाव की मरम्मत प्रक्रिया में व्यक्तिगत फाइब्रोब्लास्ट वंशावली के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल घाव की मरम्मत की मौलिक प्रक्रियाओं और तंत्र को समझने में शोधकर्ताओं को सहायता करता है, सीधे घाव भरने के परिणामों पर मॉड्यूलेटर के प्रभावों की खोज करता है।

Introduction

घाव भरना टूटे हुए घावों की बहाली की एक प्रक्रिया है। अकशेरुकी में ऊतक की चोटों के परिणामस्वरूप आंशिक या पूर्ण पुनर्जनन होता है। इसके विपरीत, स्तनधारी स्कारिंग द्वारा गहरी चोट का जवाब देते हैं, मैट्रिक्स फाइबर के घने प्लग के साथ घावों को जल्दी से सील करने के लिए तैयार की गई एक प्रक्रिया जो टूटे हुए क्षेत्र को कम करती है और एक ही समय में घायल साइट 1,2,3 को स्थायी रूप से विकृत करती है। स्तनधारियों में बड़ी त्वचा जलने या गहरे खुले घावों के परिणामस्वरूप पैथोलॉजिकल फेनोटाइप जैसे हाइपरट्रॉफिक या केलोइड निशान 4,5 होते हैं। ये विपुल निशान नैदानिक और वैश्विक स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों पर एक जबरदस्त बोझ का कारण बनते हैं। अकेले अमेरिका में, निशान प्रबंधन की लागत लगभग $ 10 बिलियन सालाना 6,7 है। इसलिए, निशान गठन में शामिल फंडेमेंटल प्रक्रियाओं और तंत्रों को बेहतर ढंग से समझने के लिए प्रासंगिक तरीकों के विकास की आवश्यकता होती है।

हाल के वर्षों में, चूहों में अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला ने कुछ त्वचा स्थानों 8,9,10 में उनकी उत्पत्ति के आधार पर अलग-अलग कार्यात्मक शक्तिके साथ विषम फाइब्रोब्लास्ट आबादी का खुलासा किया है। पीठ की त्वचा में, रिंकेविच एट अल. 2015, ने पहचाना कि Engrailed-1 (En1) की प्रारंभिक भ्रूण अभिव्यक्ति के साथ एक विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट आबादी, जिसे ईपीएफ (Engrailed positive fibroblast) कहा जाता है, घाव पर त्वचीय स्कारिंग में योगदान देता है। इसके विपरीत, एक और फाइब्रोब्लास्ट वंश जिसमें अभिव्यक्ति का कोई इतिहास नहीं है, Engrailed negative fibroblast (ENF), निशान गठन8 में योगदान नहीं करता है। Cre-संचालित ट्रांसजेनिक माउस लाइनों का उपयोग करके इन En1 वंशों का भाग्य मानचित्रण प्रतिदीप्ति रिपोर्टर माउस लाइनों जैसे R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) को पार कर गया, ईपीएफ और ईएनएफ आबादी के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।

कई दिनों में विवो में फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेशन का अध्ययन नैतिक और तकनीकी बाधाओं द्वारा सीमित है। इसके अलावा, यौगिक, वायरल और बेअसर एंटीबॉडी लाइब्रेरी स्क्रीन स्कारिंग में शामिल मार्गों को संशोधित करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। पहले इन विट्रो या पूर्व विवो मॉडल में उपयोग किए जाने वाले फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेशन और वास्तविक त्वचा माइक्रोएन्वायरमेंट में निशान गठन की कल्पना करने की क्षमता की कमी है, निशान विकास में एकरूपता, साथ ही ऊतक जटिलता जो विवो त्वचा वातावरणमें अनुकरण करती है 11,12। उपरोक्त सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने एक पूर्व विवो स्कारिंग परख विकसित की जिसे एससीएडी (एक डिश में स्कार-जैसे ऊतक) 13,14 कहा जाता है। इस सरल परख excising द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है 2 मिमी पूर्ण मोटाई epidermis युक्त त्वचा, dermis, और चमड़े के नीचे प्रावरणी क्षेत्रों और उन्हें सीरम में culturing-पूरक DMSO मीडिया में अप करने के लिए 5 दिनों के लिए. SCAD से उत्पन्न निशान मज़बूती से vivo निशान में के transcriptomic और प्रोटिओमिक हॉलमार्क दोहराते हैं। इसके अलावा, प्रासंगिक ट्रांसजेनिक माउस लाइनों (जैसे, En1 चूहों) से उत्पन्न एससीएडी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस लाइनों के साथ पार किया गया, जो एक अभूतपूर्व संकल्प पर फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेशन गतिशीलता और निशान विकास के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस मॉडल को आसानी से किसी भी उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों (जैसे, यौगिक पुस्तकालय, एंटीबॉडी लाइब्रेरी, या वायरल स्क्रीनिंग) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है 13,14। इस लेख में, हम निशान विकास में सेलुलर और मैट्रिक्स गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एससीएडी और बाद के डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग अनुप्रयोगों को उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

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Protocol

नीचे प्रस्तुत मॉडल एससीएडी परख की पीढ़ी का एक विस्तृत चरण-दर-चरण विवरण प्रदान करता है जैसा कि जियांग एट अल। एससीएडी नमूना तैयारी अंतरराष्ट्रीय और ऊपरी बवेरिया सरकार के दिशानिर्देशों के अनुसार जानवरों की बलि देने के बाद की गई थी। जानवरों को हेल्महोल्ट्ज़ सेंटर म्यूनिख की पशु सुविधा में रखा गया था। कमरों को इष्टतम आर्द्रता और 12 घंटे के प्रकाश चक्र के साथ निरंतर तापमान के साथ बनाए रखा गया था। जानवरों को भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम के साथ आपूर्ति की गई थी।

1. SCAD ऊतक तैयारी

  1. नवजात पिल्लों को प्रसवोत्तर दिन 0 या दिन 1 (पी 0 या पी 1) की बलि दें।
  2. ध्यान से कम से कम 1.5 सेमी x 1.5 सेमी पूर्ण मोटाई पृष्ठीय पीठ त्वचा जब तक कंकाल की मांसपेशी परत एक बाँझ सर्जिकल scalpel का उपयोग कर उत्पाद शुल्क.
  3. बाँझ घुमावदार संदंश का उपयोग करके त्वचा को छील लें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सतही प्रावरणी अंतर्निहित पैनिकुलस कार्नोसस मांसपेशी के साथ बरकरार है।
  4. दूषित रक्त को हटाने के लिए ठंडे डीएमईएम / एफ -12 मीडिया के 50-100 मिलीलीटर के साथ उत्पादित ऊतक को धोएं।
  5. ऊतक और सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ एक बार धोएं।
  6. DMEM / F12 मीडिया युक्त एक 10 सेमी पेट्री डिश में त्वचा को उल्टा (शीर्ष पर सतही प्रावरणी) रखें।
  7. एक डिस्पोजेबल 2 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करते हुए, पूर्ण मोटाई वाले गोल त्वचा के टुकड़ों को एक्साइज करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सतही प्रावरणी अंतर्निहित पैनिकुलस कार्नोसस मांसपेशी के साथ बरकरार है जब तक कि एपिडर्मिस एससीएडी ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए नहीं।
  8. DMEM / F12 (फिनोल लाल के बिना) के 200 μL को तैयार करें और भरें पूरा मीडिया-DMEM / F12 मीडिया 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, और 96-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
  9. बाँझ संदंश का उपयोग करते हुए, ध्यान से स्थानांतरित करें और पूरी तरह से व्यक्तिगत एससीएडी ऊतक को 96-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में उल्टा (प्रावरणी का सामना करना पड़ रहा है) को पूरी तरह से डुबो दें।
  10. मानक शर्तों (37 डिग्री सेल्सियस, 21% (वी / वी) ऑक्सीजन, 5% (वी / वी)सी 0 2, और 95% आर्द्रता) के तहत बनाए रखे गए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट को स्थानांतरित करें।

2. SCAD - ऊतक संस्कृति

  1. संस्कृति SCADs अप करने के लिए 5 दिनों के लिए एक इनक्यूबेटर में.
  2. संस्कृति के दिन 2 और दिन 4 पर, निरंतर सेल और ऊतक व्यवहार्यता की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए ताजा पूर्व-गर्म DMEM / F12 पूर्ण मीडिया के 200μl के साथ मीडिया को बदलें। प्रत्येक मीडिया परिवर्तन के दौरान उपचार यौगिकों को बदलें।
    नोट: कुओं से चिपके ऊतकों से बचने के लिए अच्छी तरह से मीडिया के 10 μL छोड़ने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. निम्नलिखित प्रयोगों के लिए एससीएडी तैयार करें: लाइव इमेजिंग (अनुभाग 3), और ऊतक कटाई और 2 डी / 3 डी इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग (अनुभाग 4)।

3. एससीएडी की लाइव इमेजिंग

  1. एक कांच की बोतल में पीबीएस में पीबीएस में कम पिघलने वाले एगरोज समाधान को उबलने तक माइक्रोवेव में गर्म करके कम से कम 30 मिलीलीटर तैयार करें।
  2. तुरंत बोतल को स्थानांतरित करें और 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तरल agarose समाधान को ठंडा करें।
  3. एक 35 मिमी पकवान के केंद्र पर ऊपर की ओर सामना करना पड़ प्रावरणी / निशान के साथ SCAD ऊतक स्थानांतरण।
  4. कमरे के तापमान (आरटी) पर एससीएडी को धीरे-धीरे एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 35 मिमी डिश पर 40 डिग्री सेल्सियस तरल एगारोज़ स्थानांतरित करके एम्बेड करें। Agarose 2 मिनट के भीतर polymerizes.
  5. पूर्व गर्म DMEM / F12 पूर्ण मीडिया के 2 एमएल जोड़ें (फिनोल लाल संकेतक के बिना)।
  6. एक confocal या एक multiphoton माइक्रोस्कोप 37 डिग्री सेल्सियस, 21% (v / v) ऑक्सीजन, 5% (v / v) C0 2, और 95% आर्द्रता के लिए सेट करने के लिए सेट एक उपयुक्त इनक्यूबेशन प्रणाली से सुसज्जित48 घंटे तक दिन 0 एससीएडी की समय-चूक छवियां प्राप्त करें।

4. ऊतक कटाई और 2 डी /

  1. बाँझ पीबीएस के साथ मीडिया को बदलकर प्रासंगिक समय बिंदुओं पर ऊतकों को धोएं।
  2. बाँझ संदंश का उपयोग करते हुए, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ऊतकों को ठीक करने के लिए 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 500 μL युक्त 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में व्यक्तिगत एससीएडी को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
  3. पीबीएस के साथ ऊतकों को तीन बार धोएं और 2 डी / 3 डी इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के साथ आगे बढ़ें।
  4. 3डी immunofluorescence धुंधला
    1. 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में incubating द्वारा ऊतकों को permeabilize करें जिसमें पीबीएस के 500 μL 0.2% जिलेटिन, 0.5% ट्राइटन-X100, और 0.01% थिमेरोसल (PBSGT) के साथ पूरक 24 घंटे के लिए RT पर।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी की पर्याप्त मात्रा तैयार करें और आरटी पर 24 घंटे के लिए पीबीएसजीटी समाधान के 150 μL में SCAD ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति के लिए इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता निर्माता द्वारा रिपोर्ट नहीं की जाती है, तो पूर्व एंटीबॉडी अनुमापन को अलग-अलग सांद्रता (उदाहरण के लिए, 1: 50, 1: 200, 1: 500, 1: 1000) का उपयोग करके नियंत्रण ऊतकों पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है।
    3. अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए पीबीएस के साथ धीरे से एससीएडी को तीन बार धोएं।
    4. RT पर रात भर पीबीएस में 1: 1000 प्रासंगिक एलेक्सा फ्लोर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक इनक्यूबेट करें।
    5. अतिरिक्त अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए पीबीएस में 30 मिनट के लिए ऊतक को तीन बार धीरे से धोएं।
    6. confocal या multiphoton इमेजिंग के लिए एक 35 मिमी ग्लास-नीचे पकवान पर ऊतक हस्तांतरण।
      नोट: जल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग करते समय, छवि अधिग्रहण के दौरान बहने को रोकने के लिए ऊतक को स्थिर करने के लिए 2% कम गलनांक agarose में SCADs एम्बेड करें
  5. 2डी immunofluorescence धुंधला
    1. ऊतक को क्रायो-मोल्ड में स्थानांतरित करें और ऊतक को पूरी तरह से विसर्जित करने के लिए इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक के साथ धीरे से भरें।
    2. धीरे से ऊतक के अभिविन्यास को समायोजित करें, एक क्रॉस-सेक्शन या ऊर्ध्वाधर अनुभाग प्राप्त करने के लिए हवा के बुलबुले की अनुपस्थिति सुनिश्चित करें।
    3. 20-30 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर मोल्ड रखें और रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक को इनक्यूबेट करें।
    4. ब्लेड का तापमान -25 डिग्री सेल्सियस और नमूना ब्लॉक तापमान को -17 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। क्रायोस्टेट का उपयोग करके 6 μm क्रायो-सेक्शन तैयार करें, अनुभागों को एक आसंजन स्लाइड पर स्थानांतरित करें, और स्लाइड को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    5. पीबीएस में स्लाइड को तीन बार कुल्ला करें और 1 घंटे के लिए पीबीएसटी (पीबीएस 0.05% ट्वीन के साथ पूरक) में 5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) डब्ल्यू / वी में स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
    6. 150μl PGST के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें
      नोट: यदि प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति के लिए इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता निर्माता द्वारा रिपोर्ट नहीं की जाती है, तो पूर्व एंटीबॉडी अनुमापन को अलग-अलग सांद्रता का उपयोग करके नियंत्रण वर्गों पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, 1: 50, 1: 200, 1: 500, 1: 1000)।
    7. अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए धीरे-धीरे पीबीएस के साथ वर्गों को तीन बार धोएं।
    8. 1: 1000 प्रासंगिक एलेक्सा फ्लोर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक incubate 2 ज के लिए आरटी पर रात भर पीबीएस में.
    9. अतिरिक्त अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए पीबीएस में 5 मिनट के लिए ऊतक को तीन बार धीरे से धोएं।
    10. DAPI युक्त एक बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड माउंट और RT पर अंधेरे में स्लाइड सूखी.
    11. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वर्गों की छवि.

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Representative Results

एससीएडी की पीढ़ी को तीन आवश्यक चरणों में विभाजित किया जा सकता है: पी 0-पी 1 चूहों से वापस त्वचा की कटाई, पूर्ण मोटाई बायोप्सी घूंसे पैदा करना, और 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 5 दिनों तक व्यक्तिगत स्कैड की बाद की संस्कृति। एक readout के रूप में, इस परख आगे scarring के स्थानिक और अस्थायी पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है. स्थानिक विश्लेषण विकासशील निशान ऊतक के भीतर सेलुलर और मैट्रिक्स घटकों के स्थानिक स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए ऊतकों के 2 डी और 3 डी प्रतिरक्षा-लेबलिंग का उपयोग करता है। Spatiotemporal अध्ययन ऊतक आंतरिक या बाह्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके इन पूर्व-सीटू निशान के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देते हैं जिन्हें प्रासंगिक 3 डी टाइम-लैप्स इमेजिंग तरीकों का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है।

इस परख में निर्णायक कदम ध्यान से पूर्ण मोटाई बायोप्सी घूंसे उत्पन्न करके प्रयोग की स्थापना कर रहे हैं, एक प्रावरणी "जेली" परत की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए, और ऊतक पूरी तरह से उल्टा नीचे डूब (epidermis 96 अच्छी तरह से प्लेटों के नीचे का सामना करना पड़ रहा है) culturing. यह समान निशान के विकास की अनुमति देता है, प्रासंगिक फाइब्रोब्लास्ट आबादी की तुलनीय प्रवासन गतिशीलता, और एससीएडी (चित्रा 1 ए) में त्वचा संकुचन। SCAD परख की बहुमुखी प्रतिभा निशान विकास के पूरे स्पेक्ट्रम भर में ऊतक कटाई की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, यदि प्रयोग का उद्देश्य स्कारिंग की प्रारंभिक गतिशीलता का अध्ययन करना है, तो स्थानिक और स्पैटिओटेम्पोरल विश्लेषण को एससीएडी संस्कृति (चित्रा 1 बी) के डी 1 या डी 2 तक सीमित किया जा सकता है।

दिन 0 और दिन 5 पर एससीएडी के प्रतिनिधि पूरे-माउंट उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों को क्रमशः चित्र 2 ए और चित्रा 2 ए में दिखाया गया है। 2 डी विश्लेषण के लिए, सेक्शनिंग के बाद ऊतक की अक्षुण्णता सुनिश्चित करने के लिए हवा के बुलबुले से रहित लंबवत अभिविन्यास में OCT में एससीएडी को एम्बेड करना आवश्यक है। इन ऊतक वर्गों को आगे हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, Masson trichrome staining-Figure 2B,2B') या Immunofluorescence staining (चित्रा 2C, 2C') En1 Cre, R26mTmG माउस पृष्ठीय डर्मिस से क्रायोसेक्शन पर; हरे रंग में ईपीएफ और लाल रंग में ईएनएफ शुरुआती (चित्रा 2 डी) और देर से चरण के निशान (चित्रा 2 डी') से।

निशान के 3 डी और 3 डी टाइम-लैप्स इमेजिंग को ऊतक (400-800 μm) के अंदर गहरे प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने की आवश्यकता होती है। दो-फोटॉन उत्तेजना का उपयोग करके निकट-अवरक्त तरंग दैर्ध्य में उत्तेजना ऊतक समाशोधन की आवश्यकता के बिना इस तरह के माप को सक्षम बनाता है, एक पद्धति जो आमतौर पर 3 डी इमेजिंग में उपयोग की जाती है ताकि प्रकाश प्रकीर्णन और अवशोषण 15,16,17 को कम करके ऊतक को पारदर्शी बनाया जा सके। हमने एक सीधा मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जो एक ट्यूनेबल लेजर के साथ संयोजन में 25x पानी-डुबकी उद्देश्य से सुसज्जित है। ऊतकों को प्रासंगिक जांच का उपयोग करके 3 डी प्रतिरक्षा धुंधला करने के अधीन किया गया था। 3 डी इमेजिंग के लिए, ऊतक को 2% कम पिघलने वाले एगारोज़ समाधान में एम्बेडेड किया गया था ताकि ऊतक में बहाव को स्थिर या रोका जा सके (चित्रा 3 ए) पानी के विसर्जन उद्देश्य के लिए आवश्यक अपवर्तक सूचकांक से मेल खाने के लिए पीबीएसजीटी के साथ सबसे ऊपर था। चित्रा 3B और चित्रा 3B में प्रतिनिधि छवि 'एन-कैडरिन प्रोटीन (गुलाबी / मैजेंटा-एलेक्सा फ्लोर 647) के अनन्य स्थानीयकरण को एक दिन के निशान साइट पर दिखाती है 5 एससीएडी एक एन 1क्रे, आर 26mTmG वापस त्वचा से; हरे रंग में ईपीएफ, और लाल रंग में ईएनएफ। 3 डी टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए, पीबीएस के बजाय फिनोल लाल संकेतक के बिना डीएमईएम / एफ 12 मीडिया के साथ सबसे ऊपर 2% कम पिघलने वाले एगारोज़ समाधान में ऊतक को एम्बेड करके उपरोक्त सेटअप में थोड़ा संशोधन किया गया था। इमेजिंग के दौरान "जीवित" एससीएडी ऊतक के लिए सही परिस्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए, एक उपयुक्त इनक्यूबेशन कक्ष जोड़ा गया था ताकि इमेजिंग के दौरान सभी फेनोटाइप सही ढंग से दर्ज किए जा सकें (चित्रा 3 सी)। प्रारंभिक फाइब्रोब्लास्ट swarms के प्रतिनिधि स्नैपशॉट चित्रा 3 डी, चित्रा 3 डी 'और चित्रा 3 डी' में निशान विकास के पहले 12 ज / शुरुआती चरणों में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: SCAD परख की योजनाबद्ध वर्कफ़्लो. (ए) प्रसवोत्तर दिन 0 / दिन 1 पिल्ले से पीछे की त्वचा को उत्पादित किया जाता है, जो निम्नलिखित त्वचीय परतों वाले ऊतक अखंडता को सुनिश्चित करता है: एपिडर्मिस (ई), पैपिलरी और रेटिकुलर डर्मिस (पीडी और आरडी), और प्रावरणी परत (एफ) के बाद 2 मिमी बायोप्सी घूंसे के बाद दिन 0 एससीएडी प्राप्त करने के लिए। (बी) एससीएडी को बाद में 5 दिनों तक के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, जिसमें एक वैकल्पिक आंतरायिक फसल / ऊतक निर्धारण चरण व्यक्तिगत प्रयोगों (बिंदीदार तीर) की प्रकृति के आधार पर दिन 2 और दिन 4 पर एक संस्कृति मीडिया परिवर्तन चरण के साथ होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 2 डी immunofluorescence धुंधला. प्रतिनिधि 2 डी रीडआउट (ए और ए') का उपयोग करके प्रारंभिक और देर से चरण के निशान का अध्ययन करने के लिए दिन 0 (ए) और दिन 5 (ए') पर ब्राइट फील्ड पूरे-माउंट छवि का उपयोग करके। (बी और बी') ऊर्ध्वाधर ऊतक वर्गों के मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग को ऊतक स्कारिंग-ऊतक संकुचन के हस्ताक्षर और निशान कोर (पीले भरे हुए त्रिकोण) पर ईसीएम के संचय को दिन 0 (बी) और दिन 5 (बी' पर प्रकट करने के लिए। (सी और सी') दिन 0 (सी) और दिन 5 (सी') एससीएडी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण En1Cre, R26mTmG वापस त्वचा से उत्पन्न होता है। EPFs को हरे रंग में, ENF को लाल रंग में, और DAPI को नीले रंग में शुरुआती (D) और देर से चरण (D') निशान से दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: योजनाबद्ध सेटअप और 3D spatio और spatiotemporal विश्लेषण के लिए SCADs के प्रतिनिधि readouts. (A) एक ईमानदार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत 2% कम पिघलने वाले तापमान agarose जेल में SCADs एम्बेड करने की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और (B) एक 3D immunofluorescent दाग दिन की प्रतिनिधि छवि 5 SCAD En1Cre, R26mTmG से उत्पन्न माउस डर्मिस और एन-कैडरिन एंटीबॉडी (मैजेंटा) के साथ प्रतिरक्षा-सना हुआ। EPFs हरे रंग में दिखाए जाते हैं और ENFs लाल रंग में दिखाए जाते हैं। (सी) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 3 डी इमेजिंग एससीएडी सेटअप एक इनक्यूबेशन कक्ष से सुसज्जित है: 37 डिग्री सेल्सियस, 21% (वी / वी) ऑक्सीजन, 5% (वी / वी) सी 02, और 95% आर्द्रता। (डी) लाइव इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम दिन 0 और दिन 1 चरण एससीएडी के पहले 12 घंटे में फाइब्रोब्लास्ट झुंड (सफेद धराशायी सर्कल) की प्रगति की शुरुआती घटनाओं को दिखाते हैं। (ई) डी, डी और डी पर अलग-अलग फाइब्रोब्लास्ट्स के एकल-सेल ट्रैक किए गए सेलुलर प्रक्षेपवक्रों का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

चोट के बाद निशान गठन को समझने के लिए कई मॉडल पहले से ही विकसित किए गए हैं। हालांकि इस संबंध में बहुत सारी प्रगति प्रदान की गई है, लेकिन, वास्तविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं हैं। पिछली तकनीक के विपरीत, एससीएडी मॉडल में सभी सेल प्रकार और त्वचीय परतों को शामिल किया गया है, जिससे देशी त्वचा की जटिलता18,19 को बनाए रखा जा सकता है। यह पद्धति मौलिक डेटासेट उत्पन्न करने में सक्षम है जो आणविक तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण हैं जो निशान गठन को चलाते हैं। परख एक तरह से है कि सरल, minimalistic है, अभी तक मौलिक और कार्यात्मक readouts है कि fibroblast प्रवास, ईसीएम जमाव, epidermal / यह विवो सेटअप की तुलना में अपेक्षाकृत कम जटिल है, और नमूने के संबंध में विचलन को कम किया जा सकता है। इसके अलावा, इस परख आसानी से उच्च throughput विश्लेषण पाइपलाइनों के साथ युग्मित किया जा सकता है. जिसमें पूरे स्पेक्ट्रम या अवरोधकों या उत्प्रेरकों के पुस्तकालयों जैसे रासायनिक यौगिकों, बेअसर एंटीबॉडी, siRNA, या वायरल तरीके जो स्कारिंग को कम या बढ़ावा देते हैं, उन्हें कम से कम मात्रा में उत्पादित ऊतकों के सापेक्ष आसानी से लागू किया जा सकता है। इस पूर्व विवो निशान मॉडल की सीमा के बारे में, इस परख को फेनोटाइपिक या गतिशील पहलुओं का अध्ययन करने के लिए लागू नहीं किया जा सकता है ए) निशान विकास में गैर-निवासी प्रतिरक्षा झुंड बी) संवहनीकरण सी) निशान परिपक्वता के रूप में ऊतक के रूप में 5 दिनों के बाद चोट से परे व्यवहार्य नहीं है।

बायोप्सी घूंसा छांटने से पहले, यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक में कोई अवशिष्ट रक्त शेष नहीं होना चाहिए क्योंकि यह प्रयोग की कार्यवाही में हस्तक्षेप कर सकता है। यदि आवश्यक हो तो हम ऊतक को एचबीएसएस के साथ एक से अधिक बार धोने की सलाह देते हैं, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऊतक से किसी भी अवशिष्ट रक्त को समाप्त कर दिया गया है। इसके अलावा, वैकल्पिक दिनों में मीडिया को बदलने के लिए विशेष देखभाल के साथ प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि, ऊतक के छोटे आकार के कारण त्वचीय और एपिडर्मल परतें अलग हो सकती हैं। इसलिए, वास्तविक प्रयोगों को शुरू करने से पहले प्रक्रिया का ठीक से अभ्यास करना आवश्यक है। ऊतक परतों के बार-बार अलगाव से बचने के लिए, हम सुझाव देते हैं कि मीडिया परिवर्तन के दौरान, ऊतक को स्थिर करने और अच्छी तरह से जोड़े गए मीडिया के कारण ऊतक पर सतह के तनाव में परिवर्तन को कम करने के लिए ताजा मीडिया के साथ बदलने से पहले अवशिष्ट मीडिया के 10 μl को रखा जा सकता है।

2 डी विश्लेषण पाइपलाइनों के लिए, हम एक ब्लॉक में ऊतक को माउंट करने से पहले कुछ मिनटों के लिए कमरे के तापमान पर तरल इष्टतम काटने के तापमान यौगिक के साथ ऊतक को संतुलित करने की सलाह देते हैं। यह सेक्शनिंग के दौरान बर्फ क्रिस्टल गठन के कारण ऊतक पृथक्करण को रोकता है। 3डी/3डी टाइम-लैप्स इमेजिंग पाइपलाइनों को उपलब्ध माइक्रोस्कोप पद्धति के आधार पर पर्याप्त रूप से संशोधित किया जाना चाहिए। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के लिए (पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ या बिना), एगरोज में ऊतक को एम्बेड करना या सुपरग्लू का उपयोग करना इमेजिंग के दौरान ऊतक के भौतिक बदलाव को रोकता है। जल विसर्जन उद्देश्यों को पीबीएस या रंगहीन मीडिया (फिनोल लाल के बिना) का उपयोग करके 3 डी / 3 डी टाइम-लैप्स इमेजिंग की अनुमति देते हैं। एक उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए, ऊतक को ग्लास-बॉटम / इमेजिंग प्लेट पर रखा जा सकता है और कम पिघलने वाले तापमान की एक बूंद का उपयोग करके स्थिर किया जा सकता है और लाइव इमेजिंग के दौरान व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त मीडिया के साथ सबसे ऊपर है। दोनों तौर-तरीकों में, इमेजिंग के दौरान सही तापमान, आर्द्रता और गैस की आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए एक संगत इनक्यूबेशन प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है।

अंत में, एससीएडी मॉडल उपन्यास आणविक संकेतों और स्तनधारी घाव भरने में शामिल यांत्रिक मार्गों की पहचान और लक्षण वर्णन को सक्षम बनाताहै 13,14। प्रोटोकॉल एससीएडी की पीढ़ी और संभावित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों और विश्लेषण का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है ताकि निशान विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सके।

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Disclosures

सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की।

Acknowledgments

हम एससीएडी पद्धति13 के विकास में योगदान देने के लिए जियांग एट अल 2020 के सभी सह-लेखकों को स्वीकार करते हैं। हम Multiphoton प्रणाली तक पहुंच के लिए लुडविग-Maximilans-Universität में डॉ Steffen Dietzel और Bioimaging कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं। Y.R. Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), यूरोपीय अनुसंधान परिषद समेकितकर्ता अनुदान (ERC-CoG 819933), और LEO फाउंडेशन (LF-OC-21-000835) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Tween 20, Nonionic Detergent Biorad Laboratories 1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract Sigma A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL LIFE Technologies 11039021
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides Fisher scientific J1800AMNZ Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL LIFE Technologies  10500064
Fluoromount-G with DAPI Life Technologies 00 4959 52 Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length Fisher Scientific 12381369
Gelatin from porcine skin Sigma G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL LIFE Technologies 35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL LIFE Technologies 14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 Ibidi 11922
Ibidi Heating system Ibidi 10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm Leica Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids LIFE Technologies 11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g Biozym /Lonza 859081
OCT Embedding Matrix Carlroth 6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL VWR International 43368.9M
Pen-Strep Gibco 15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm Stiefel 270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm Fisher Scientific 15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101% Sigma-Aldrich T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope Zeiss

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References

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जीव विज्ञान अंक 182
ScAD परख का उपयोग कर निशान विकास visualizing - एक <em>पूर्व सीटू</em> त्वचा Scarring परख
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Ramesh, P., Ye, H., Dasgupta, B.,… More

Ramesh, P., Ye, H., Dasgupta, B., Machens, H. G., Rinkevich, Y. Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay. J. Vis. Exp. (182), e63808, doi:10.3791/63808 (2022).

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