Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid
Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg > 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.
Abstract
Das Newcastle-Disease-Virus (NDV), auch bekannt als Vogelorthoavulavirus-Serotyp-1, ist ein einzelsträngiges RNA-Virus mit negativem Sinn, das sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff entwickelt wurde. NDV ist aufgrund seines gut etablierten reverse-genetischen Systems, seiner starken immunstimulierenden Eigenschaften und seines ausgezeichneten Sicherheitsprofils ein attraktives therapeutisches und prophylaktisches Mittel. Bei der Verabreichung als onkolytisches Virus oder viral-vektorisierter Impfstoff löst NDV eine robuste Antitumor- oder Antigen-spezifische Immunantwort aus, die sowohl den angeborenen als auch den adaptiven Arm des Immunsystems aktiviert.
Angesichts dieser wünschenswerten Eigenschaften wurde NDV in zahlreichen klinischen Studien untersucht und ist eines der am besten untersuchten onkolytischen Viren. Derzeit gibt es zwei registrierte klinische Studien mit NDV: eine zur Bewertung eines rekombinanten NDV-vektorisierten Impfstoffs für SARS-CoV-2 (NCT04871737) und eine zweite zur Bewertung eines rekombinanten NDV, das Interleukin-12 kodiert, in Kombination mit Durvalumab, einem AntiPD-L1-Antikörper (NCT04613492). Um die Weiterentwicklung dieses vielversprechenden viralen Vektors zu erleichtern, sind vereinfachte Methoden zur Erzeugung von rekombinantem NDV (rNDV) mit hohem Titer-, In-vivo-Grad erforderlich.
Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Amplifikation von rNDV in spezifizierten pathogenfreien (SPF) embryonierten Hühnereiern und zur Reinigung von rNDV aus Allantoikflüssigkeit mit Verbesserungen zur Verringerung des Verlusts während der Reinigung. Ebenfalls enthalten sind Beschreibungen der empfohlenen Qualitätskontrollassays, die durchgeführt werden sollten, um den Mangel an Kontaminanten und die Virusintegrität zu bestätigen. Insgesamt ermöglicht dieses detaillierte Verfahren die Synthese, Reinigung und Speicherung von hochtiteren, in vivo gradigen, rekombinanten, lentogen und mesogenen NDV für den Einsatz in präklinischen Studien.
Introduction
Newcastle Disease Virus, auch bekannt als Avian Orthoavulavirus-1, ist ein umhülltes aviäres Paramyxovirus mit dem Potenzial, sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff 1,2,3,4,5,6,7 verwendet zu werden. In jüngster Zeit wurde NDV, das zur Expression des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 entwickelt wurde, als wirksamer intranasales Impfstoff in den Maus- und Hamster-Challenge-Modellen 7,8,9 charakterisiert. Wenn es als Krebsimmuntherapie verwendet wird, führt es zur Rekrutierung angeborener Immunzellen, insbesondere natürlicher Killerzellen, zur Produktion von Typ-I-Interferon und zur Erzeugung von antitumorspezifischen T-Zellen10,11,12,13. Zusätzlich zu diesen starken immunstimulierenden Eigenschaften hat NDV ein starkes Sicherheitsprofil und ein gut etabliertes umgekehrtes Genetiksystem14,15. Diese wünschenswerten Eigenschaften haben zur Bewertung von NDV in zahlreichen präklinischen und humanklinischen Studien geführt (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Um diesen vielversprechenden, immunstimulierenden viralen Vektor weiter voranzubringen, sind detaillierte Methoden zur Herstellung und Reinigung von hochtiterem, hochreinem NDV erforderlich, das sicher in vivo verabreicht werden kann.
Da NDV ein Vogelparamyxovirus ist, wird es am häufigsten in embryonierten Hühnereiern amplifiziert. Während es zellbasierte Systeme zur Vermehrung von NDV gibt, waren die meisten nicht in der Lage, Titer zu produzieren, die denen ähneln, die in embryonierten Hühnereiern18 erreicht wurden. Dennoch gibt es einige Nachteile bei der Herstellung von NDV in Eiern, einschließlich der Tatsache, dass die Produktion auf Eibasis langwierig und nicht leicht skalierbar ist, die Beschaffung großer Mengen von SPF-Hühnereiern problematisch sein kann und das Potenzial für eine Kontamination mit Eiallergenen besteht13,18,19,20 . Kürzlich hat eine Gruppe gezeigt, dass Vero-Zellen, die in Suspension in serumfreiem Medium gezüchtet wurden, die Replikation von NDV zu Titern unterstützen können, die mit denen vergleichbar sind, die in Eiern vor der Reinigungerreicht wurden 21. Dies erforderte jedoch eine serielle Übertragung des Virus, um das Virus an Vero-Zellen anzupassen, und die Optimierung einer Methode zur Reinigung von NDV aus Suspensions-Vero-Zellen ist immer noch erforderlich21.
Wie bereits erwähnt, variieren die Methoden zur Reinigung von High-Titer-In-vivo-Viren je nach dem betreffenden Virus22. Für die Erzeugung rekombinanter NDV steht ein gut etabliertes System der umgekehrten Genetik zur Verfügung. Dieser Prozess, bei dem ein cDNA-Klon, Helferplasmide und ein Helfervirus verwendet werden, das die T7-RNA-Polymerase exprimiert, wurde zuvor ausführlich beschrieben 15,23. Dieses Protokoll kann entweder auf lentogene oder mesogene NDV angewendet werden. Das in diesem Protokoll beschriebene Virus ist ein rekombinantes mesogenes NDV, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria kodiert, das zwischen viralen P- und M-Genen als individuelle Transkriptionseinheit eingefügt wurde, da dies zuvor als optimaler Ort für die Insertion von Fremdtransgenen beschrieben wurde24.
Geschlossene Methoden beschreiben die Reinigung von NDV basierend auf seiner Größe, die von 100 bis 500 nm reicht, und seiner Dichte15. Dies ermöglichte die Erzeugung von In-vivo-haltigen, hochtiteren NDV-Beständen in etwa 3 Wochen, beginnend mit dem Empfang der Eier bis hin zu einem endgültigen Titer. Es werden Techniken beschrieben, die häufig bei der großtechnischen Produktion von Viren auf Eibasis verwendet werden, wie z. B. Tangentialflussfiltration, Tiefenfiltration und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, die die Übertragung dieser Methoden auf die Produktion in größerem Maßstab ermöglichen. Zuvor beschriebene Techniken zur Reinigung von NDV wurden durch den Einbau eines virusstabilisierenden Puffers, die Verwendung von Iodixanol während der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und die Beschreibung verschiedener Qualitätskontrollmaßnahmen zur Sicherstellung der In-vivo-Qualität verbessert 15. Dies hat die Reinigung von In-vivo-Qualität NDV ermöglicht, die Titer von bis zu 3 × 1010 PFU / ml von 0,8 bis 1,0 L Allantoikflüssigkeit erreicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viren, die in präklinischen Studien als Therapeutika verwendet werden, müssen bei der Verabreichung in vivo15 stark gereinigt werden, um Toxizität zu vermeiden. Wenn zufällige Agenzien oder Verunreinigungen nicht entfernt werden, kann dies zu schweren Nebenwirkungen führen, die die therapeutische Wirkung des viralen Wirkstoffszunichte machen 28. Da NDV in embryonierten Hühnereiern hergestellt wird, gibt es mehrere kontaminierende Eiproteine wie Eieralbumin, d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.G.E.Y erhielt ein PhD-Stipendium des Ontario Veterinary College und ein Ontario Graduate Scholarship. Diese Arbeit wurde durch Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants an SKW (Grant # 304737) und LS (Grant # 401127) finanziert.
Materials
| 0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
| 10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
| Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
| L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
| Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
| Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
| Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |
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