Produção de Vírus da Doença de Newcastle Recombinante de Alta Titer a partir de fluido allantóico
Summary
Aqui fornecemos um procedimento detalhado para produção, purificação e quantificação do vírus recombinante da doença de Newcastle. Este protocolo rende consistentemente > 6 × 109 unidades formadoras de placas/mL, fornecendo quantidades de vírus apropriadas para estudos in vivo em animais. Ensaios adicionais de controle de qualidade para garantir a segurança in vivo são descritos.
Abstract
O vírus da doença de Newcastle (NDV), também conhecido como sorotipo-1 ortoavulavírus aviário, é um vírus de RNA de uma única faixa que foi desenvolvido tanto como um vírus oncolítico quanto uma vacina viral vetorial. O NDV é um agente terapêutico e profilático atraente devido ao seu sistema genético reverso bem estabelecido, propriedades imunostimulatórias potentes e excelente perfil de segurança. Quando administrado como um vírus oncílico ou uma vacina viral vetorial, o NDV provoca uma resposta imune robusta ou específica de antígeno, ativando os braços inatos e adaptativos do sistema imunológico.
Dadas essas características desejáveis, o NDV tem sido avaliado em inúmeros ensaios clínicos e é um dos vírus oncolíticos mais bem estudados. Atualmente, existem dois ensaios clínicos registrados envolvendo NDV: um avaliando uma vacina recombinante de NDV vetored para SARS-CoV-2 (NCT04871737), e um segundo avaliando um NDV recombinante codificando Interleukin-12 em combinação com Durvalumab, um anticorpo antiPD-L1 (NCT04613492). Para facilitar o avanço desse vetor viral altamente promissor, são necessários métodos simplificados para gerar ndv de alto nível, in vivo e recombinante (rNDV).
Este artigo descreve um procedimento detalhado para amplificar o rNDV em ovos de galinha embrionados sem patógenos especificados (SPF) e purificar o rNDV do fluido allantóico, com melhorias para reduzir a perda durante a purificação. Também estão incluídas descrições dos ensaios de controle de qualidade recomendados, que devem ser realizados para confirmar a falta de contaminantes e integridade do vírus. No geral, este procedimento detalhado permite a síntese, purificação e armazenamento de alto título, in vivo-grau, recombinante, lentogênico e mesogênico NDV para uso em estudos pré-clínicos.
Introduction
O Newcastle Disease Virus, também conhecido como Ortoavulavírus-1, é um paramyxovírus aviário envolto com potencial para ser usado tanto como um vírus oncolítico quanto como uma vacina viralvetorial 1,2,3,4,5,6,7. Mais recentemente, o NDV projetado para expressar a proteína de pico de SARS-CoV-2 tem sido caracterizado como uma vacina intranasal eficaz nos modelos de desafio de camundongos ehamsters 7,8,9. Quando usado como imunoterapia contra o câncer, resulta no recrutamento de células imunes inatas, especificamente células assassinas naturais, produção de interferon tipo I, e a geração de células T específicas do antitumoral 10,11,12,13. Além dessas potentes propriedades imunoestimulatórias, o NDV possui um forte perfil de segurança e um sistema genético reverso bem estabelecido14,15. Essas características desejáveis têm solicitado a avaliação do NDV em numerosos ensaios clínicos pré-clínicos e humanos (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Para avançar ainda mais este vetor viral altamente promissor e estimulante imunológico, métodos detalhados são necessários para produzir e purificar ndv ultra-puro de alta titer que pode ser administrado com segurança in vivo.
Como o NDV é um paramyxovírus aviário, é mais frequentemente amplificado em ovos de galinha embrionados. Embora existam sistemas baseados em células disponíveis para propagação de NDV, a maioria não foi capaz de produzir títulos semelhantes aos alcançados em ovos de galinha embrionados18. No entanto, existem algumas desvantagens na produção de NDV em ovos, incluindo o fato de que a produção à base de ovos é longa e não facilmente escalável, a fonte de grandes quantidades de ovos de galinha SPF pode ser problemática, e existe o potencial de contaminação com alérgenos de ovos 13,18,19,20 . Recentemente, um grupo mostrou que as células Vero cultivadas em suspensão em meio livre de soro podem suportar a replicação de NDV para titers comparáveis aos obtidos em ovos, antes da purificação21. No entanto, isso exigiu a passagem serial do vírus para adaptar o vírus às células Vero, e a otimização de um método para purificar o NDV das células Vero suspensas ainda é necessária21.
Como destacado anteriormente, os métodos utilizados para purificar o vírus de alto nível, in vivo de grau, variam dependendo do vírus na questão22. Existe um sistema genético reverso bem estabelecido disponível para a geração de NDV recombinante. Este processo, envolvendo o uso de um clone cDNA, plasmídeos auxiliares e um vírus auxiliar que expressa polimerase T7 RNA, foi descrito anteriormente em detalhes15,23. Este protocolo pode ser aplicado a NDV lentogênico ou mesogênico. O vírus descrito neste protocolo é um NDV mesogênico recombinante codificando a proteína fluorescente verde (GFP) da água-viva Aequorea victoria inserida entre genes P e M virais como uma unidade de transcrição individual, pois este foi descrito anteriormente como o local ideal para a inserção de transgenesestrangeiros 24.
Os métodos fechados descrevem a purificação do NDV com base em seu tamanho, variando de 100 a 500 nm, e sua densidade15. Isso permitiu que a geração de estoques NDV de alto nível e alto nível em aproximadamente 3 semanas, a partir de quando os ovos são recebidos até ter um título final. São descritas técnicas frequentemente utilizadas na produção em larga escala de vírus à base de ovos, como filtração de fluxo tangencial, filtração de profundidade e ultracentrifugação de gradiente de densidade, permitindo a tradução desses métodos para uma produção em maior escala. Técnicas descritas anteriormente para a purificação do NDV foram aprimoradas pela incorporação de um tampão estabilizador de vírus, uso de iodixanol durante a ultracentrifugação de gradiente de densidade e pela descrição de várias medidas de controle de qualidade para garantir a qualidade in vivo 15. Isso permitiu a purificação de NDV de grau vivo atingindo títulos de até 3 × 1010 PFU/mL de 0,8 a 1,0 L de fluido allantóico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os vírus utilizados como agentes terapêuticos em estudos pré-clínicos devem ser altamente purificados para evitar a toxicidade quando administrados in vivo15. Se agentes aventureiros ou contaminantes não forem removidos, isso pode levar a reações adversas graves negando o efeito terapêutico do agente viral28. Como o NDV é produzido em ovos de galinha embrionados, existem várias proteínas de ovos contaminantes, como a ovalbumina, que devem ser removidas a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.G.E.Y foi o beneficiário de uma bolsa de doutorado da Faculdade de Veterinária de Ontário e uma bolsa de pós-graduação em Ontário. Este trabalho foi financiado pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants to SKW (grant #304737) e LS (grant #401127).
Materials
| 0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
| 10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
| Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
| L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
| Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
| Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
| Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |
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