Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخراج الحويصلات خارج الخلية من الدم المحيطي والأنسجة الصلبة مع التنميط اللاحق للمستضدات السطحية وشحنات البروتين.
Abstract
تمثل الحويصلات خارج الخلية المنتشرة والمقيمة في الأنسجة (EVs) أهدافا واعدة كمؤشرات حيوية علاجية جديدة ، وتظهر كلاعبين مهمين في الحفاظ على التوازن العضوي وتطور مجموعة واسعة من الأمراض. بينما يركز البحث الحالي على توصيف الإكسوسومات الداخلية ذات الأصل الإندوسومي ، اكتسبت الحويصلات الدقيقة التي تتدفق من غشاء البلازما اهتماما متزايدا في الصحة والمرض ، والتي تتميز بوفرة من الجزيئات السطحية التي تلخص توقيع الغشاء للخلايا الأم. هنا ، يتم تقديم إجراء قابل للتكرار يعتمد على الطرد المركزي التفاضلي لاستخراج وتوصيف المركبات الكهربائية من البلازما والأنسجة الصلبة ، مثل العظام. يصف البروتوكول كذلك التنميط اللاحق للمستضدات السطحية وشحنات البروتين من المركبات الكهربائية ، والتي يمكن تتبعها بالتالي لاشتقاقاتها وتحديدها بمكونات تتعلق بالوظيفة المحتملة. ستكون هذه الطريقة مفيدة للتحليل الترابطي والوظيفي والميكانيكي للمركبات الكهربائية في الدراسات البيولوجية والفسيولوجية والمرضية.
Introduction
تم اقتراح الحويصلات خارج الخلية (EVs) لتحديد الهياكل خارج الخلية المغلقة بطبقة ثنائية من الدهون1 ، والتي تلعب أدوارا مهمة في مختلف الأحداث الفسيولوجية والمرضية2. يمكن تقسيم EVs التي تطلقها الخلايا السليمة على نطاق واسع إلى فئتين رئيسيتين ، وهما exosomes (أو EVs الصغيرة) التي تشكلت من خلال مسار الاتجار داخل الخلايا3 والحويصلات الدقيقة (أو EVs الكبيرة) التي طورها التبرعم الخارجي لغشاء البلازماللخلية 4. بينما تركز العديد من الدراسات على وظيفة EVs التي تم جمعها من الخلايا المستزرعة في المختبر5 ، فإن EVs المشتقة من الدورة الدموية أو الأنسجة أكثر تعقيدا وغير متجانسة ، والتي لها ميزة تعكس الحالة الحقيقية للكائن الحي في الجسم الحي6. علاوة على ذلك ، يمكن لجميع أنواع الأنسجة تقريبا إنتاج EVs في الجسم الحي ، ويمكن أن تعمل هذه المركبات الكهربائية كرسائل داخل الأنسجة أو يتم نقلها بواسطة سوائل الجسم المختلفة ، وخاصة الدم المحيطي ، لتسهيل الاتصال الجهازي7. EVs في الدورة الدموية والأنسجة هي أيضا أهداف لتشخيص الأمراض وعلاجها8.
في حين تمت دراسة الإكسوسومات بشكل مكثف في السنوات الأخيرة ، فإن الحويصلات الدقيقة لها أيضا وظائف بيولوجية مهمة ، والتي يمكن استخراجها بسهولة دون الطرد المركزي الفائق ، وبالتالي تعزيز البحوث الأساسية والسريرية9. والجدير بالذكر أن القضية الحرجة المتعلقة بالمركبات الكهربائية المعزولة من الدورة الدموية والأنسجة هي أنها مشتقة من أنواع مختلفة من الخلايا10. نظرا لأن الحويصلات الدقيقة يتم نفخها من غشاء البلازما وتتميز بوفرة من جزيئات سطح الخلية9 ، فإن استخدام علامات غشاء الخلية الأم لتحديد الأصل الخلوي لهذه المركبات الكهربائية أمر ممكن. على وجه التحديد ، يمكن تطبيق تقنية قياس التدفق الخلوي (FC) للكشف عن علامات الغشاء. علاوة على ذلك ، يمكن للباحثين عزل المركبات الكهربائية وإجراء مزيد من التحليلات بناء على الشحنات الوظيفية.
يوفر البروتوكول الحالي إجراء شاملا لاستخراج وتوصيف المركبات الكهربائية من عينات الجسم الحي. يتم عزل المركبات الكهربائية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي ، ويشمل توصيف المركبات الكهربائية التحديد المورفولوجي عبر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ، وتحليل الأصل عبر FC ، وتحليل شحنة البروتين عبر اللطخة الغربية. يتم استخدام بلازما الدم وعظم الفك العلوي للفئران كممثلين. يمكن للباحثين الرجوع إلى هذا البروتوكول للمركبات الكهربائية من مصادر أخرى وإجراء التعديلات المقابلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية للجامعة الطبية العسكرية الرابعة وإرشادات ARRIVE. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام الفئران C57Bl / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع (لا يوجد تفضيل للإناث أو الذكور). يوضح الشكل 1 الخطوات المتبعة في عزل المركبات الكهربائية للبلازما والأنسجة. يتم أخذ البلازما كممثل لوصف إجراء عزل EV من سوائل الجسم. يتم أخذ عظم الفك العلوي كممثل لشرح إجراء عزل EV من الأنسجة الصلبة.
1. تحضير عينات البلازما وعظم الفك العلوي
- قم بإعداد عينات البلازما باتباع الخطوات أدناه.
- تحديد وزن جسم الماوس باستخدام ميزان المختبر القياسي.
- أضف 20 ميكرولتر ، 2 مجم / مل من الهيبارين إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل واستخدم جهاز الخلاط (انظر جدول المواد) للسماح للهيبارين بالالتصاق بجدار الأنبوب.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أنابيب منع التخثر مباشرة لجمع الدم. - تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق ل 50 ملغم / كغم من الصوديوم بنتوباربيتال (انظر جدول المواد). أمسك عنق الفأر بالإبهام والسبابة ، ثم ثبت الذيل والساق الخلفية اليسرى بالإصبع الصغير وحقن الصوديوم البنتوباربيتال بحقنة حقن 1 مل بعد تعريض البطن.
- تأكد من تخدير الفأر بشكل صحيح بناء على عدم وجود منعكس القرنية ورد فعل الأطراف عند قرص وسادة القدم.
- حلق الشعر على الوجه ورموش العينين بمقص منحني.
- أمسك جلد الرقبة للماوس واضغط على الجلد حول العينين إلى الجزء الخلفي من الرقبة حتى تبرز مقلة العين. استخدم ملاقط العيون لتثبيت مقلة العين بسرعة ، وجمع تدفق الدم باستخدام أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل المعدة في الخطوة 1.1.2. التضحية بالماوس عن طريق خلع فقرة عنق الرحم.
تنبيه: كن حذرا مع الشعر والرموش لأنها قد تسبب انحلال الدم. - اقلب الأنبوب برفق رأسا على عقب عدة مرات لمنع تخثر الدم.
تنبيه: اقلب الأنبوب رأسا على عقب في أسرع وقت ممكن. - الطرد المركزي عينة الدم لمدة 15 دقيقة عند 1200 × جم عند 4 درجات مئوية.
- انقل المادة الطافية بعناية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 مل ، واستخدم عينة البلازما على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لبضع ساعات.
- تمييع طاف مع حجم متساو من 1x محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS) وتخلط جيدا.
ملاحظة: البروتوكول المقدم أعلاه لجمع البلازما قاتل. يمكن أيضا جمع الدم من خلال ثقب الوريد تحت الترقوة11 دون التضحية بالماوس.
- قم بإعداد عينات عظم الفك العلوي باتباع الخطوات أدناه.
- عزل عظم الفك العلوي بملاقط ومقص العيون وغسلها ب PBS للتخلص من الأنسجة الرخوة بالملاقط.
- ضع عظم الفك العلوي في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل وقطع العظم إلى قطع صغيرة (يجب أن يكون الحجم أقل من 1 مم في القطر) بالمقص. أضف كمية معينة من الليبراز (5 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) لتغطية الأنسجة (عادة 1 مل لعينات العظام من فأر عمره 8 أسابيع) ، ثم احتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي العينة عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- انقل بعناية المادة الطافية باستخدام ماصة إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 مل.
2. استخراج المركبات الكهربائية
- أجهزة الطرد المركزي العينات (المحضرة في الخطوة 1.1.10 والخطوة 1.2.4) لمدة 15 دقيقة عند 2500 × جم (4 درجات مئوية) لإزالة حطام الخلايا الكبيرة والصفائح الدموية المتبقية.
- انقل المواد الطافية بعناية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية).
ملاحظة: يمكن ضبط سرعة الطرد المركزي على أكثر من 10000 × جم لاستخراج المركبات الكهربائية12. كلما زادت سرعة أجهزة الطرد المركزي ، يمكن الحصول على كمية أكبر من المركبات الكهربائية. نظرا لأن الحد الأقصى لسرعة جهاز الطرد المركزي الذي استخدمناه هو 16800 × جم (انظر جدول المواد) ، فقد اخترنا هذه السرعة في هذا البروتوكول. - تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في كل أنبوب ب 1 مل من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية).
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في كل أنبوب باستخدام 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. قم بتخزين هذه العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تقل عن 24 ساعة فقط ، أو يفضل استخدامها على الفور للتحليلات التالية (الخطوات 3-5).
تنبيه: التخزين عند -80 درجة مئوية غير مقبول ، لأن هذا سيقلل من تركيز المركبات الكهربائية ويزيد من أحجام الجسيمات في المركبات الكهربائية13 ، مما يؤثر على التحليل التالي للمركبات الكهربائية.
3. التعرف المورفولوجي للمركبات الكهربائية
- إجراء تحليل NTA.
- وفقا لكمية EVs (يتم الحكم عليها تقريبا من خلال حجم الكريات ، فإن جزيئات البلازما 50 ميكرولتر هي الحد الأدنى) ، قم بنقل 5-50 ميكرولتر من إعادة التعليق (الخطوة 2.4) ، وقم بتخفيفه في 10 مل من محلول المخزن المؤقت (تمت تصفية PBS بفلتر 0.22 ميكرومتر) ، واخلطه مع أطراف ماصة صغيرة سعة 1 مل بشكل كاف. استخدم هذا التعليق النهائي لقياس الجسيمات.
- استخدم حقنة معقمة سعة 1 مل لحقن ما لا يقل عن 5 مل من الماء المقطر بسرعة معتدلة وثابتة حتى يصبح عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف أقل من خمسة.
ملاحظة: بعد حقن 1 مل من الماء المقطر عبر القناة بأكملها ، يظهر عدد الجسيمات مباشرة على واجهة الكشف. إذا كان العدد لا يزال أكثر من خمسة ، فاستمر في حقن 1 مل من الماء المقطر حتى يتم استيفاء المعايير. - أعد تكوين 1 ميكرولتر من محلول المعايرة في 1 مل من الماء المقطر لتوليد محلول أولي ، ثم خذ 100 ميكرولتر من المحلول الأولي إلى 25 مل من الماء المقطر لإعداد محلول مخزون قياسي (1: 250,000). تخزين هذا الكاشف العامل في 4 °C لمدة 1 أسبوع.
- قم بمعايرة أداة NTA باستخدام حل المخزون القياسي (الخطوة 3.1.3). قم بحقن 1-5 مل من محلول معايرة العمل بحقنة معقمة سعة 1 مل لشطف قناة الماكينة حتى يتراوح عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف بين 50-400 (يفضل حوالي 300). قم بتشغيل برنامج المعايرة.
- كرر الخطوة 3.1.2 لشطف قناة الماكينة قبل كل قياس للعينة.
- استخدم حقنة معقمة سعة 1 مل لحقن ما لا يقل عن 2 مل من المحلول العازل لشطف قناة الماكينة بسرعة ثابتة حتى يصبح عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف أقل من 10.
- حقن 1 مل من عينة EV المحضرة في الخطوة 3.1.1 بسرعة معتدلة وثابتة (السرعة الموصى بها هي 0.5-1 مل / ثانية).
ملاحظة: التركيز الأمثل للجسيمات هو جعل عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف يتراوح بين 50-400 ، ويفضل أن يكون حوالي 300. إذا كان عدد الجسيمات مرتفعا جدا ، كرر الخطوة 3.1.2 لشطف قناة الماكينة على الفور لتجنب احتباس الجسيمات عند جدار القناة وضبط تركيز عينة EV بالخطوة 3.1.1 ، ثم كرر من الخطوة 3.1.5. - قم بإجراء تحليل الجسيمات وإنشاء تقارير التحليل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- إذا كانت العينة ثمينة ، فقم بضخ عينة EV مرة أخرى باستخدام حقنة سعة 1 مل وجمعها في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل. كرر الخطوة 2.2 لاستخراج المركبات الكهربائية.
- بعد اكتشاف جميع العينات ، قم بحقن ما لا يقل عن 2 مل من المحلول العازل لقناة الماكينة ثم حقن 5 مل على الأقل من الماء المقطر حتى يصبح عدد الجسيمات المعروضة على واجهة الكشف أقل من خمسة.
- استخدم حقنة معقمة سعة 5 مل لحقن ما لا يقل عن 10 مل من الهواء بسرعة ثابتة (السرعة الموصى بها هي 1 مل / ثانية) لإزالة الماء في القناة.
- إجراء تحليل TEM.
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية باستخدام أنظمة تعليق جديدة للمركبات الكهربائية. شبكة المجهر الإلكتروني المطلي بالكربون formvar لها جانبان ، مع كون جانب العمل مضيئا في الشبكات المركزية. الحد الأدنى لحجم البلازما لاستخراج EVs للإجراء أدناه هو 50 ميكرولتر.- امزج عينة EV (الخطوة 2.4) مع حجم متساو من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). قم بإيداع 4 ميكرولتر من المركبات الكهربائية على شبكة واحدة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- ضع أربع قطرات من PBS (قطرة واحدة تساوي 50 ميكرولتر) على ورقة من فيلم البولي إيثيلين (انظر جدول المواد). انقل الشبكات بملاقط مجهرية نظيفة واغسل جانب العمل من الشبكة في PBS من قطرة إلى أخرى.
- استخدم أوراق الترشيح لإزالة PBS الإضافية التي بقيت في الشبكات.
- احتضان جانب العمل من الشبكة إلى 1٪ حمض الفوسفوتونجستيك (انظر جدول المواد) لمدة دقيقتين ثم كرر الخطوة 3.2.2.
تنبيه: نظرا لأن حمض الفوسفوتونجستيك سام ، يجب تشغيل هذا الإجراء في غطاء الدخان ، ويجب إعادة تدوير حمض الفوسفوتونجستيك الزائد على وجه التحديد بدلا من التخلص منه مباشرة. - ضع الشبكات ووجهها لأعلى في طبق 10 سم مغطى بأوراق الترشيح. يمكن تخزين الشبكات في RT لعدة سنوات.
- راقب الشبكات تحت المجهر الإلكتروني باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: لضمان ملاحظة الجسيمات المفردة ، يجب ضبط تركيز المركبات الكهربائية ، ويجب أن يكون التعليق واضحا دون تعكر واضح. قبل الإسقاط ، يجب أن تكون العينة مختلطة جيدا. يتم عرض تحليلات TEM و NTA التمثيلية في الشكل 2.
4. تحليل منشأ المركبات الكهربائية
ملاحظة: يتطلب تحديد الأصل الخلوي للمركبات الكهربائية تطبيق الأجسام المضادة لعلامات غشاء الخلية النموذجية. الحد الأدنى لحجم البلازما لاستخراج EVs للإجراء أدناه هو 300 ميكرولتر. بناء على هياكل الطبقة الثنائية الدهنية للمركبات الكهربائية ، يمكن استخدام صبغة الغشاء لتمييزها. بالنسبة لعينات بلازما الدم ، يتم اختيار CD18 للخلايا الليمفاوية14 للتمثيل. بالنسبة لعينات عظم الفك العلوي ، يتم اختيار المستقبلات المرتبطة بالخلايا الآكلة للعظم (OSCAR) ل osteoclasts15 كمثال. قبل FC ، تأكد من تكييف مقياس التدفق الخلوي لقياس EVs16 ، حيث يختلف حد الحجم الأدنى إلى حد كبير بين مقاييس التدفق الخلوي المتميزة.
- أعد تعليق العينات (الخطوة 2.4) باستخدام 500 ميكرولتر من PBS وانقل 50 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي جديد ونظيف سعة 1.5 مل كعنصر تحكم فارغ (الأنبوب A) و 50 ميكرولتر أخرى في أنبوب طرد مركزي جديد ونظيف سعة 1.5 مل كأنبوب تلطيخ بسيط ل FITC (الأنبوب B). أضف 0.5 ميكرولتر من صبغة الغشاء إلى الأنبوب الأساسي لتلطيخ الغشاء. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
- جهاز الطرد المركزي الأنبوب الأساسي لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية). تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- قسم كل عينة سعة 50 ميكرولتر إلى أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل لأنابيب التلوين البسيطة ل PE (الأنبوب C) ، وتلطيخ علامات السطح (الأنبوب D) ، وأدوات التحكم في الأجسام المضادة الثانوية فقط (الأنبوب E).
- أضف الجسم المضاد الأساسي ل OSCAR في عينات EV العظمية بالإضافة إلى الجسم المضاد CD18 في عينات EV البلازما (انظر جدول المواد) إلى الأنبوب B (الخطوة 4.1) والأنبوب D (الخطوة 4.3) بشكل منفصل (مخفف عند 1: 100). احتضان لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية). تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الكريات ب 500 ميكرولتر من PBS ، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 30 دقيقة عند 16800 × جم (4 درجات مئوية) لإزالة الأجسام المضادة الأولية الإضافية.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات ب 50 ميكرولتر من PBS ، متبوعا بإضافة أجسام مضادة ثانوية مقترنة ب FITC (انظر جدول المواد) ، على التوالي (مخففة عند 1: 200) (الأنبوب E). أضف نفس الأجسام المضادة الثانوية إلى الأنبوب B (الخطوة 4.1) والأنبوب D (الخطوة 4.3). احتضان جميع الأنابيب لمدة 1 ساعة ، عند 4 درجات مئوية في الظلام.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة المترافقة بالفلورة المباشرة لمعالجة اكتشاف FC باستخدام عناصر التحكم المناسبة في النمط المتماثل. - قم بتخفيف قطرة واحدة من تعليق حبات بحجم 0.2 و 0.5 و 1 ميكرومتر (انظر جدول المواد) على التوالي إلى 1 مل من PBS ، وقم بتشغيل كل حبة حجم أولا للتأكد من البوابة المختارة للمركبات الكهربائية. قم بتعيين عتبة مقياس التدفق الخلوي للبحث عن الخرز وسكان EV باستخدام تشتت أمامي مناسب (FSC) وتشتت جانبي (SSC).
- اضبط الحالة النهائية على حساب 100000 جسيم مصبوغ بالغشاء. قم بتحليل العينة عبر مقياس التدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 3.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام معدات NTA ذات القنوات الفلورية لتحليل المنشأ ، وإعداد العينة هو نفسه FC.
- اضبط الحالة النهائية على حساب 100000 جسيم مصبوغ بالغشاء. قم بتحليل العينة عبر مقياس التدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 3.
5. تحليل محتوى البروتين من EVs
ملاحظة: يتم إجراء تحليل محتوى البروتين داخل المركبات الكهربائية عن طريق اللطخة الغربية. على سبيل المثال ، تم اختيار EVs البلازما والعظام لتحليل 6-فوسفوغلوكونات ديهيدروجيناز (PGD) وبيروفات كيناز M2 (PKM2) لحالة التمثيل الغذائي. تم استخدام Golgin84 (عضية Golgi) كعنصر تحكم سلبي ، وتم استخدام Flotillin (بروتين الغشاء) و Caveolin (بروتين متكامل من caveolae) و β-actin (الهيكل الخلوي)17 كعنصر تحكم إيجابي في EVs مقارنة بعينات الخلايا. تم اختيار Mitofilin و α-Actinin-4 كعلامات EV كبيرة ، بينما تم اختيار CD9 و CD81 كعلامات EV صغيرة لإظهار المجموعات الفرعيةEV 18. تم اختيار Apoa1 كعلامة الجسيمات الشحمية في البلازما19. للحصول على تفاصيل الكاشف ذات الصلة ، انظر جدول المواد.
- أعد تعليق الكريات (الخطوة 2.4) في 50 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- حدد تركيزات البروتين لجميع العينات في الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا بواسطة مقايسة بروتين BCA باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- خفف 2 ملغم/مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) مع 0.9٪ من محلول ملحي طبيعي (NS) (يحتوي على 0.9٪ (وزن/حجم) من كلوريد الصوديوم) إلى 0.5 ملغم/مل. أضف 0.5 ملغم / مل من BSA و 0.9٪ من NS إلى ثلاثة آبار مكررة بأحجام معينة ، كما هو موضح في الجدول 1.
- أسقط 2 ميكرولتر من العينات (الخطوة 5.1) وأضف 18 ميكرولتر من NS إلى ثلاثة آبار مكررة بشكل منفصل.
- قم بإعداد محلول عملي عن طريق خلط كاشف BCA A مع الكاشف B (50: 1 الكاشف A: B). أضف 200 ميكرولتر من محلول العمل إلى كل بئر ورجه برفق لمدة 30 ثانية.
- احتضان الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا لمدة 20-25 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- قم بقياس OD عند 596 نانومتر بواسطة مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد).
- تصدير البيانات.
- ارسم منحنى قياسيا واحسب تركيز البروتين في العينات.
- وفقا للنتائج ، قم بتخفيف العينات إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع 0.9٪ من NS و 5x SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت (250 mM Tris · حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 6.8 ، 10٪ SDS ، 30٪ (v / v) الجلسرين ، 10 مللي متر DTT ، 0.05٪ (وزن / حجم) بروموفينول أزرق ، انظر جدول المواد). أغلق الأنابيب بغشاء محكم وسخنها لمدة 5 دقائق عند 100 درجة مئوية.
- قم بتحميل العينات وسلم البروتين في تركيز متدرج من 4٪ -20٪ Hepes-Tris gel (انظر جدول المواد).
ملاحظة: اختر نسبة الجل وفقا للوزن الجزيئي للبروتينات ذات الأهمية. - قم بتشغيل الجل في المخزن المؤقت للتشغيل عند 80 فولت حتى تشكل البروتينات خطا ، ثم قم بالتبديل إلى 120 فولت لمدة 1 ساعة حتى تصبح صبغة التحميل في قاع الجل.
ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل وفقا للمعدات المستخدمة أو نوع الجل وتركيزه. - انقل الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) (انظر جدول المواد) ، المحتضن مسبقا في كحول الميثيل لمدة 20 ثانية. استخدم نظام النقل الرطب للنقل لمدة 1 ساعة عند 200 مللي أمبير.
تنبيه: تأكد من عدم وجود فقاعة داخل نظام النقل والحفاظ على غشاء PVDF رطبا.
ملاحظة: قد يختلف وقت النقل وفقا للوزن الجزيئي للبروتين المستهدف ؛ 1 دينار كويتي يحتاج عادة إلى دقيقة واحدة. - قم بإعداد مخزن مؤقت لحجب BSA بنسبة 5٪ عن طريق إضافة 2.5 جم من BSA (انظر جدول المواد) في 50 مل من محلول ملحي Tween (TBST) (2 مل من Tween مضاف في 2 لتر من محلول PBS) في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. تحريك حتى يذوب مسحوق. سد الأغشية في هذا المخزن المؤقت لمدة 2 ساعة في RT مع الإثارة.
- احتضان الأغشية بأجسام مضادة أولية محددة مخففة ب TBST إلى تركيز مناسب (ميتوفيلين ، 1: 1000 ؛ α-أكتينين -4 ، 1: 1000 ؛ CD9 ، 1: 1000 ؛ CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; جولجين 84 ، 1: 1000 ؛ الأسطول-1، 1:1000; كافولين -1 ، 1: 1000 ؛ PGD ، 1: 1000 ؛ PKM2 ، 1: 1000 ؛ β-أكتين ، 1: 3000) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل (2 مل من توين مضاف في 2 لتر من محلول PBS) أربع مرات (15 دقيقة في كل مرة) ، واحتضان الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 1: 4000 لمدة 1 ساعة في RT مع الإثارة.
- اغسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل أربع مرات (15 دقيقة في كل مرة) ، وقم بتصوير الأغشية باستخدام مجموعة التلألؤ الكيميائي ونظام التصوير الهلامي (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفقا لسير العمل التجريبي ، يمكن استخراج EVs من الدم المحيطي والأنسجة الصلبة (الشكل 1). يبلغ عظم الفك العلوي للفأر الذي يبلغ من العمر 8 أسابيع حوالي 0.1 ± 0.05 جم ، ويمكن جمع حوالي 300 ميكرولتر من البلازما من الماوس. باتباع خطوات البروتوكول ، يمكن جمع 0.3 ملغ و 3 ميكروغرام من EVs ، على التوالي. كما تم تحليلها بواسطة TEM و NTA ، فإن الخصائص المورفولوجية النموذجية للمركبات الكهربائية هي حويصلات غشائية مستديرة على شكل كوب يتراوح قطرها من 50-300 نانومتر (الشكل 2). يمكن ل FC اكتشاف المركبات الكهربائية ذات العلامات الغشائية تحت ضوابط مفيدة ، ويظهر تحليل FC النسب المئوية لعلامات غشاء محددة يتم التعبير عنها على EVs والتي تشير إلى أصلها من الخلايا الأم (الشكل 3). يظهر تحليل اللطخة الغربية تعبير PGD و PKM2 ، على التوالي ، كممثل لمحتوى البروتين في EVs البلازما و EVs العظام ، مما يشير إلى حالة التمثيل الغذائي (الشكل 4). تم الكشف أيضا عن التعبير السلبي ل Golgin84 في المركبات الكهربائية مع وجود Mitofilin و α-Actinin-4 و Flotillin-1 و Caveolin-1 و β-actin ، والتي يتم تخصيبها بشكل شائع في EVs الكبيرة المشتقة من غشاء البلازما (الحويصلات الدقيقة). يمكن أيضا اكتشاف علامة EV الصغيرة CD9 ، في حين أن تعبير CD81 منخفض أو غائب ، مع عدم وجود Apoa1 في EVs البلازما (الشكل 4).
الشكل 1: توضيح لبروتوكول استخراج المركبات الكهربائية. أ: خطوات استخراج المركبات الكهربائية لبلازما الدم الطرفية باستخدام الطرد المركزي التفاضلي. (ب) خطوات استخراج المركبات الكهربائية للأنسجة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التعرف المورفولوجي للمركبات الكهربائية. (أ) صورة المجهر الإلكتروني النافذ التمثيلي (TEM) التي تعرض مورفولوجيا المركبات الكهربائية. شريط المقياس = 200 نانومتر. (ب) تظهر صور تحليل تتبع الجسيمات النانوية التمثيلية (NTA) ونتائج القياس الكمي توزيع الحجم وعدد الجسيمات للمركبات الكهربائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل منشأ المركبات الكهربائية. أ: مجموعات الأنابيب المختلفة ذات عناصر التحكم المختلفة في التجربة. (ب) توزيع حبات بحجم 1 ميكرومتر و0.5 ميكرومتر و0.2 ميكرومتر موضح في التمثيل البياني. (ج) رسوم بيانية تمثيلية للكثافة توضح PBS (الأنبوب A) ، والتلوين البسيط للمركبات الكهربائية (الأنبوب B) ، والتلوين البسيط لصبغة الغشاء (الأنبوب C) ، والتلوين المزدوج لعينات EV (الأنبوب D). (د) تحليل التدفق الخلوي للنسبة المئوية للمركبات الكهربائية الإيجابية CD18 في EVs بلازما الدم باللون الأحمر مقارنة بالجسم المضاد الثانوي فقط باللون الأسود. (ه) تحليل التدفق الخلوي للنسبة المئوية للمركبات الكهربائية الإيجابية ل OSCAR من عينات العظام باللون الأحمر مقارنة بالجسم المضاد الثانوي فقط باللون الأسود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل محتوى البروتين للمركبات الكهربائية. (أ) اللطخة الغربية التمثيلية لصور EV البلازمية التي تظهر وجود نازعة هيدروجين 6-فوسفوغلوكونات (PGD) وميتوفيلين و α-أكتينين-4 و CD9 و Flotillin-1 و Caveolin-1 و β-actin في EVs البلازمية والتعبير السلبي ل CD81 و Golgin84 و Apoa1. (ب) لطخة غربية تمثيلية لصور EV العظمية تظهر وجود البيروفات كيناز M2 (PKM2) وميتوفيلين ، α-أكتينين-4 ، CD9 ، CD81 ، أسطول -1 ، كافولين -1 ، و β-أكتين في EVs العظمية والتعبير السلبي ل Golgin84. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| رقم | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (ميكرولتر) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (ميكرولتر) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
الجدول 1: حل العمل القياسي لمقايسة BCA. أضف 0.5 ملغم / مل من BSA و 0.9٪ من NS إلى ثلاثة آبار مكررة ، كما هو موضح في الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عند دراسة ميزات ومصير ووظيفة المركبات الكهربائية ، من الضروري عزل المركبات الكهربائية ذات العائد العالي والتلوث المنخفض. توجد طرق مختلفة لاستخراج المركبات الكهربائية ، مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، ومقايسات التقاط المناعة 4,20. هنا ، تم استخدام واحدة من أكثر الطرق شيوعا ، الطرد المركزي التفاضلي. مزايا هذا هو أنه لا يستغرق وقتا طويلا ، فإنه يولد غلة عالية من المركبات الكهربائية مع سهولة العزل عن عينات محدودة ، والقدرة على تعديل الطريقة بناء على مصدر العينة المستخدمة. لتحليل وظيفة تدوير المركبات الكهربائية ، من الأفضل اختيار بلازما الدم ، والتي يمكن أن تعكس بشكل أفضل الحالة الحقيقية للمركبات الكهربائية في الجسم الحي ، بدلا من المصل. وذلك لأن العديد من المركبات الكهربائية المشتقة من الصفائح الدموية سيتم إطلاقها أثناء عملية تكوين الجلطة لجمع المصل21 ، بينما تتم إزالة الصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي قبل عزل المركبات الكهربائية من البلازما22. تجدر الإشارة إلى أن اختيار مضادات التخثر لعزل البلازما EV لا يزال مثيرا للجدل. ترتبط آلية الهيبارين المضادة للتخثر ارتباطا وثيقا بعلم وظائف الأعضاء. وبالتالي ، قد تكون المركبات الكهربائية المعزولة أكثر انعكاسا للحالة في الجسم الحي. وتجدر الإشارة إلى أن الهيبارين سوف يسبب قراءات PCR سلبية كاذبة ويمنع امتصاص EV من قبل الخلايا23,24. الكواشف الأخرى المضادة للتخثر ، مثل EDTA أو سترات الصوديوم ، لديها أيضا نقص ، بما في ذلك السمية الحيوية ، مما يؤثر على الخواص الكيميائية للبلازما والصفائح الدموية. بشكل جماعي ، بالنظر إلى المعلومات المذكورة أعلاه ، يتم اختيار الهيبارين في هذه الدراسة. لإزالة الصفائح الدموية ، تم طرد العينات بالطرد المركزي بسرعة 2,500 × جم قبل 16,800 × جم ، مما قد يزيل بعض المركبات الكهربائية الكبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، بالنظر إلى أن العديد من المركبات الكهربائية داخل البلازما اللزجة سوف تلتصق بالصفائح الدموية ويتم إزالتها ، يقترح تخفيف البلازما بحجم متساو من PBS قبل إزالة الصفائح الدموية من خلال الطرد المركزي لتحسين إنتاجية المركبات الكهربائية. من الجدير بالذكر أنه من الأفضل استخدام تدرج السكروز مع الطرد المركزي الفائق لتنقية المركبات الكهربائية لإزالة تلوث البروتين القابل للذوبان ، مثل بوليمرات البروتين21.
حتى الآن ، تشمل الطرق الشائعة لتوصيف المركبات الكهربائية NTA و TEM و FC16 واللطخة الغربية ، من بين أمور أخرى25. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب تغيير مورفولوجيا وكمية المركبات الكهربائية بعد استعادتها في ظروف مختلفة13 ، نقترح معالجة الكشف في أقرب وقت ممكن بعد استخراج المركبات الكهربائية. إلى جانب ذلك ، أوصى Görgens et al. باستخدام برنامج تلفزيوني مكمل بالألبومين البشري والتريهالوز (PBS-HAT) للحفاظ عليه بشكل أفضل من PBS26 النقي. يجب إجراء التحديد المورفولوجي للمركبات الكهربائية عبر NTA و TEM مباشرة بعد إجراء الاستخراج ، وإلا فقد يتغير شكل المركبات الكهربائية27. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام Cryo-EM28 للمراقبة المورفولوجية المتقدمة للمركبات الكهربائية ، والتي لها فوائد الحفاظ على الشكل بشكل أفضل بدقة أعلى. إلى جانب NTA ، يمكن أيضا قياس تركيز الجسيمات بواسطة FC بمساعدة كمية معروفة من عد الخرز29 ، لكن هذه الطريقة ليست مستقرة للغاية ، والحساسية للجزيئات الصغيرة منخفضة بالنسبة ل FC. علاوة على ذلك ، نظرا لاكتشاف السرب للجزيئات الصغيرة باستخدام FC30 ، فمن الأفضل استخدام NTA لتحديد الحجم. وبالمثل ، يمكن أيضا تحليل أصل المركبات الكهربائية بواسطة NTA باستخدام مرشحات مضانة. بالمقارنة مع FC ، فإن NTA أكثر حساسية للجزيئات الأصغر ولديها ميزة محتملة تتمثل في إعادة تدوير العينة لإجراء تجارب أخرى. تتمثل إحدى مزايا استخدام FC في أنه يمكن إثراء الأنواع الفرعية المحددة من المركبات الكهربائية بأجسام مضادة غشائية مترافقة بالفلوروكروم28. أيضا ، يمكن دراسة وظيفة مستضدات سطحية معينة من خلال تجارب فقدان الوظيفة ، مثل استخدام الأجسام المضادة المعادلة28. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام 1٪ Triton X-100 لتدمير طوف الدهون في غشاء EVs ، وبالتالي كعنصر تحكم للكشف عن إشارات الغشاء31. علاوة على ذلك ، يمكن للباحثين استخدام خصائص الغشاء المحددة لإنشاء ناقلات الأدوية المستهدفة32.
تستخدم اللطخة الغربية على نطاق واسع لتحليل محتويات البروتين في المركبات الكهربائية. تمت التوصية بالعديد من العلامات مثل Mitofilin و caveolin و α-Actinin-418 كمرشحين لتحديد المركبات الكهربائية الكبيرة في الدراسات الحديثة ؛ يتم إثراء CD9 في المركبات الكهربائية الصغيرة بدلا من المركبات الكهربائية الكبيرة ، و CD81 و CD63 و Syntenin-1 وفيرة على نطاق واسع في المركبات الكهربائية الصغيرة18. أما بالنسبة لنتائج اللطخة الغربية ، فإن العلامات مثل Mitofilin و CD9 متغيرة في ظروف حيوانية مختلفة. يمكن افتراض أن المركبات الكهربائية المعزولة تمثل مجموعة مختلطة من السكان ، حيث تكون المركبات الكهربائية الكبيرة واحدة من السكان الفرعيين الرئيسيين. للتحقق من نقاء EVs ، يقترح إضافة الكشف عن البروتينات العضية / النووية ، مثل Lamin B أو Golgin84 ، كعنصر تحكم سلبي. أما بالنسبة لمركبات البلازما EVs ، وفقا لنتائجنا ، فإن Apoa1 الذي يمثل الجسيمات الشحمية لا يتم إثراؤه في المركبات الكهربائية التي تم جمعها. أحد قيود هذه الطريقة هو أنه من الصعب التمييز بين البروتينات الموجودة على السطح وتلك الموجودة داخل الحويصلة. لذلك ، يمكن تطبيق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لتحليل البروتين الغشائي كتجارب تكميلية. علاوة على ذلك ، مع تطوير التسلسل عالي الإنتاجية ، يمكن للباحثين الاستفادة من رسم الخرائط البروتينية33 لتحليل تكوين البروتين في المركبات الكهربائية ، مع الحاجة أيضا إلى التحقق من البروتينات المستهدفة بواسطة اللطخة الغربية.
باختصار ، توفر هذه الدراسة بروتوكولا مجديا لعزل وتوصيف EVs في الدورة الدموية والأنسجة ، بما في ذلك تحليل مصادر الخلايا ومحتويات البروتين ، مما يساعد على إنشاء أساس لمزيد من التجارب الوظيفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000974 و 81870796 و 82170988 و 81930025) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2019M663986 و BX20190380). نحن ممتنون للمساعدة التي قدمها المركز الوطني التجريبي للتدريس التجريبي للطب الأساسي (AMFU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
- Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
- Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
- In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T.
- Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
- Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
- Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
- Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
- Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
- Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
- Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
- Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
- Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
- Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
