마우스에서 리소포스파티딜콜린-유도된 초점 탈수초화 모델의 안정적으로 확립된 투포인트 주사
Summary
본 프로토콜은 마우스에서 안정하고 재현가능한 탈수초화 모델을 생성하기 위해 입체택시 프레임을 통해 리소포스파티딜콜린의 두 점 주사를 기술한다.
Abstract
수용체-매개 lysophospholipid 신호전달은 다양한 신경 질환, 특히 다발성 경화증 (MS)의 병태생리학에 기여한다. 리소포스파티딜콜린(LPC)은 염증과 관련된 내인성 리소포스포지질이며, 미엘린 지질에 대한 독성으로 빠른 손상을 유도하여 초점 탈수초화를 유도할 수 있다. 여기에서, 심각한 탈수초화를 직접적으로 야기하고 외과적 절차에 의해 마우스에서 실험적 탈수초화 손상을 신속하고 안정적으로 복제할 수 있는 입체 전술 이점 LPC 주사에 대한 상세한 프로토콜이 제시된다. 따라서, 이 모델은 탈수초화 질환, 특히 MS와 매우 관련이 있으며, 임상적으로 관련된 연구를 진행시키는 데 기여할 수 있다. 또한, LPC를 주입한 마우스의 코퍼스 캘로섬에서 탈수초화의 시간 과정을 묘사하기 위해 면역형광 및 룩솔 패스트 블루 염색 방법을 사용하였다. 또한, 행동 방법은 모델링 후 마우스의 인지 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 전반적으로, 입체택시 프레임을 통한 리소포스파티딜콜린의 두 점 주사는 추가 연구를 위해 마우스에서 탈수초화 모델을 생성하는 안정하고 재현가능한 방법이다.
Introduction
수용체-매개 lysophospholipid 신호전달은 거의 모든 장기 시스템의 다양한 생리학적 과정을 수반한다1. 중추 신경계 (CNS)에서,이 신호 전달은 다발성 경화증 (MS)과 같은자가 면역 신경 질환의 병원성에 중요한 역할을합니다. 다발성 경화증은 병리학적 탈수초화 및 염증 반응을 특징으로 하는 만성 면역 매개 장애로, 신경학적 기능 장애 및 인지 장애를 일으킨다2,3. 초기 질병 동안 지속적인 재발 및 재발 후, 대부분의 환자는 결국 이차적 인 진행성 단계로 진행하여 뇌에 돌이킬 수없는 손상을 입히고 이로 인한 장애를 일으킬 수 있습니다4. 이차-진행성 과정의 병리학적 특징은 염증성 병변에 의한 탈수초성 플라크5라고 여겨진다. MS에 대한 기존의 치료법은 재발의 위험을 상당히 줄일 수 있습니다. 그러나, 진행성 MS6에 의해 야기된 장기간의 탈수초성 손상에 대한 효과적인 치료법은 여전히 없다. 따라서, 백질 변성에 초점을 맞춘 전임상 치료제를 연구하기 위해서는 안정하게 확립되고 쉽게 재현 가능한 모델이 요구된다.
탈수초화와 수초화는 다발성 경화증 발병의 두 가지 주요 병리학 적 과정입니다. 탈수초화는 전염증성 표현형7을 가진 미세아교세포에 의해 유도되는 축삭돌기 주위의 미엘린 외피의 손실이며, 이는 신경 충동의 느린 전도를 유도하고 뉴런 및 신경 장애의 손실을 초래한다. Remyelination은 희소 돌기 세포에 의해 매개되는 내인성 복구 반응으로, 장애는 신경 퇴행 및인지 장애로 이어질 수 있습니다8. 염증 반응은 전체 과정에 결정적이며, 미엘린 손상과 복구의 정도에 모두 영향을 미칩니다.
따라서, 지속성 염증성 탈수초화의 안정한 동물 모델은 MS에 대한 치료 전략의 추가 탐구에 의미가 있다. MS의 복잡성으로 인해, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE), 독성-탈수초성 모델, 큐프리존(CPZ), 및 리소포스파티딜콜린(LPC)9을 포함하는 생체 내에서 탈수초성 병변을 모방하기 위한 다양한 유형의 동물 모델이 확립되었다9 . LPC는 염증과 관련된 내인성 lysophospholipid이며, 미엘린 지질에 대한 독성으로 빠른 손상을 유도하여 초점 탈수초화를 유발할 수 있습니다. 이전 보고서 및 연구10,11에 기초하여, 일부 수정과 함께 두 점 주입의 상세한 프로토콜이 제공된다. 일반적으로, 고전적인 원포인트 LPC 주사 모델은 주사 부위에서 국소 탈수초화만을 생성하며 종종 자발적 수초화12,13을 동반한다. 그러나, 이점 주사 LPC 모델은 LPC가 마우스 코퍼스 캘로섬에서 탈수초화를 직접 유도할 수 있고 미엘린 재생이 거의 없는 더 내구성 있는 탈수초화를 야기할 수 있음을 입증할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MS, CNS의 만성 탈수초성 질환은 젊은 성인20에서 신경 기능 장애의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 임상적으로, MS 환자의 약 60%-80%는 이차-진행성 MS21,22를 개발하기 전에 재발 및 재발의 사이클을 경험하고, 결국 시간 23에 따른 누적 운동 장애 및 인지 결핍을 초래한다. 현재, 어떠한 단일 실험 모델도 질환…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (Grants : 82071380, 81873743)의 지원을 받았습니다.
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
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