Стабильно установленная двухточечная инъекция лизофосфатидилхолин-индуцированной модели фокального демиелинирования у мышей
Summary
Настоящий протокол описывает двухточечную инъекцию лизофосфатидилхолина через стереотаксическую рамку для создания стабильной и воспроизводимой модели демиелинизации у мышей.
Abstract
Рецептор-опосредованная лизофосфолипидная сигнализация способствует патофизиологии различных неврологических заболеваний, особенно рассеянного склероза (РС). Лизофосфатидилхолин (LPC) является эндогенным лизофосфолипидом, связанным с воспалением, и он может вызывать быстрое повреждение с токсичностью липидов миелина, что приводит к очаговому демиелинизации. Здесь представлен подробный протокол стереотаксической двухточечной инъекции LPC, которая может непосредственно вызвать тяжелую демиелинизацию и быстро и стабильно воспроизвести экспериментальную демиелинизацию у мышей с помощью хирургической процедуры. Таким образом, эта модель очень актуальна для демиелинических заболеваний, особенно РС, и она может способствовать соответствующему продвижению клинически значимых исследований. Кроме того, иммунофлуоресценция и методы быстрого синего окрашивания Luxol были использованы для изображения временного хода демиелинизации в мозолистом теле мышей, которым вводили LPC. Кроме того, поведенческий метод использовался для оценки когнитивной функции мышей после моделирования. В целом, двухточечная инъекция лизофосфатидилхолина через стереотаксическую рамку является стабильным и воспроизводимым методом создания модели демиелинизации у мышей для дальнейшего изучения.
Introduction
Рецептор-опосредованная передача лизофосфолипидов включает в себя разнообразные физиологические процессы практически всех систем органов1. В центральной нервной системе (ЦНС) эта сигнализация играет решающую роль в патогенах аутоиммунных неврологических заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС). Рассеянный склероз является хроническим иммуноопосредованным расстройством, характеризующимся патологической демиелинизацией и воспалительной реакцией, вызывающей неврологическую дисфункцию и когнитивные нарушения 2,3. После непрерывного рецидива и ремиттирования во время раннего заболевания большинство пациентов в конечном итоге прогрессируют до вторично-прогрессирующей стадии, что может привести к необратимому повреждению мозга и, как следствие, инвалидности4. Считается, что патологической отличительной чертой вторично-прогрессирующего течения являются демиелинизирующие бляшки, вызванные воспалительными поражениями5. Существующие методы лечения РС могут значительно снизить риск рецидива. Тем не менее, до сих пор нет эффективной терапии для долгосрочного демиелинизирующего повреждения, вызванного прогрессирующимMS 6. Таким образом, стабильно установленная и легко воспроизводимая модель требуется для изучения доклинических терапевтических средств, которые фокусируются на дегенерации белого вещества.
Демиелинизация и ремиелинизация являются двумя основными патологическими процессами при развитии рассеянного склероза. Демиелинизация – это потеря миелиновой оболочки вокруг аксонов, индуцированная микроглией с провоспалительными фенотипами7, и это приводит к медленной проводимости нервных импульсов и приводит к потере нейронов и неврологическим расстройствам. Ремиелинизация представляет собой эндогенную реакцию репарации, опосредованную олигодендроцитами, где расстройства могут привести к нейродегенерации и когнитивным нарушениям8. Воспалительная реакция имеет решающее значение для всего процесса, влияя как на степень повреждения миелина, так и на восстановление.
Таким образом, стабильная животная модель стойкой воспалительной демиелинизации имеет значение для дальнейшего изучения терапевтических стратегий для РС. Из-за сложности РС были установлены различные типы моделей животных для имитации демиелинизирующих поражений in vivo, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE), токсико-демиелинизирующие модели, купризон (CPZ) и лизофосфатидилхолин (LPC)9 . LPC является эндогенным лизофосфолипидом, связанным с воспалением, и он может вызывать быстрое повреждение с токсичностью липидов миелина, что приводит к очаговой демиелинизации. На основе предыдущих отчетов и исследований10,11 приведен подробный протокол двухточечной инъекции с некоторыми модификациями. Как правило, классическая одноточечная модель инъекции LPC производит только местную демиелинизацию в месте инъекции и часто сопровождается спонтанной ремиелинизацией12,13. Тем не менее, двухточечная инъекционная модель LPC может продемонстрировать, что LPC может непосредственно индуцировать демиелинизацию в мозолистом теле мыши и вызывать более длительную демиелинизацию с небольшой регенерацией миелина.
Protocol
Representative Results
Discussion
РС, хроническое демиелинизирующее заболевание ЦНС, является одной из наиболее распространенных причин неврологической дисфункции у молодых людей20 лет. Клинически примерно 60%-80% пациентов с РС испытывают цикл рецидивов и ремиссий до развития вторично-прогрессирующего РС<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (гранты: 82071380, 81873743).
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. 발생학. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
