Édition génique CRISPR/Cas9 de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour des applications de thérapie génique
Summary
Le présent protocole décrit une procédure optimisée de culture de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) pour la greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.
Abstract
CRISPR / Cas9 est un outil d’édition de gènes très polyvalent et efficace largement adopté pour corriger diverses mutations génétiques. La faisabilité de la manipulation génique des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) in vitro fait des HSPC une cellule cible idéale pour la thérapie génique. Cependant, les HSPC perdent modérément leur potentiel de greffe et de repeuplement multilignée en culture ex vivo . Dans la présente étude, des conditions de culture idéales sont décrites qui améliorent la greffe de HSPC et génèrent un nombre accru de cellules génétiquement modifiées in vivo. Le rapport actuel présente des conditions de culture in vitro optimisées, y compris le type de milieu de culture, la supplémentation unique en cocktail de petites molécules, la concentration de cytokines, les plaques de culture cellulaire et la densité de culture. En plus de cela, une procédure optimisée d’édition de gènes HSPC, ainsi que la validation des événements d’édition de gènes, sont fournies. Pour la validation in vivo , la perfusion de HSPC génétiquement modifiée et l’analyse post-greffe chez des souris receveuses sont affichées. Les résultats ont démontré que le système de culture augmentait la fréquence des CSH fonctionnelles in vitro, ce qui entraînait une greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.
Introduction
L’inaccessibilité aux donneurs compatibles avec l’antigène leucocytaire humain (HLA) dans les contextes de transplantation allogénique et le développement rapide d’outils de génie génétique hautement polyvalents et sûrs font de la greffe autologue de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) une stratégie de traitement curatif pour les maladies hématologiques héréditaires 1,2. La thérapie génique par cellules souches et progénitrices hématopoïétiques autologues (HSPC) implique la collecte des HSPC des patients, la manipulation génétique, la correction des mutations pathogènes et la transplantation de HSPC corrigés par les gènes chez le patient 3,4. Cependant, le succès de la thérapie génique repose sur la qualité du greffon génétiquement modifié transplantable. Les étapes de manipulation génique et la culture ex vivo des HSPC affectent la qualité du greffon en diminuant la fréquence des cellules souches hématopoïétiques à long terme (CSH-LT), nécessitant la perfusion de fortes doses de HSPCmanipulées par les gènes 2,5,6.
Plusieurs petites molécules, dont SR1 et UM171, sont actuellement utilisées pour étendre les HSPC dans le sang de cordon ombilical de manière robuste 7,8. Pour les HSPC adultes, en raison du rendement cellulaire plus élevé obtenu lors de la mobilisation, une expansion robuste n’est pas nécessaire. Cependant, conserver la souche des HSPC isolés en culture ex vivo est crucial pour ses applications de thérapie génique. Par conséquent, une approche axée sur l’enrichissement de la culture de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est développée en utilisant une combinaison de petites molécules: resvératrol, UM729 et SR1 (RUS)7. Les conditions de culture HSPC optimisées favorisent l’enrichissement des CSH, ce qui entraîne une augmentation de la fréquence des CSH génétiquement modifiées in vivo, et réduit la nécessité de manipuler de grandes doses de HSPC, facilitant ainsi des approches de thérapie génique rentables8.
Ici, un protocole complet pour la culture HSPC est décrit, ainsi que la perfusion et l’analyse de cellules génétiquement modifiées in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le succès de la thérapie génique HSPC repose principalement sur la qualité et la quantité de CSH greffables dans le greffon. Cependant, les propriétés fonctionnelles des CSH sont fortement affectées pendant la phase préparatoire des produits de thérapie génique, y compris par la culture in vitro et la toxicité associée à la procédure de manipulation génique. Pour surmonter ces limitations, nous avons identifié des conditions de culture HSPC idéales qui conservent la souche des CSH CD34 + CD133 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’installation de cytométrie en flux et de l’animalerie du CSCR. A. C. est financé par une bourse ICMR-SRF, K. V. K. est financé par une bourse DST-INSPIRE et P. B. est financé par une bourse CSIR-JRF. Ce travail a été financé par le Département de biotechnologie du gouvernement indien (subvention n° BT/PR26901/MED/31/377/2017 et BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
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