עריכת גנים CRISPR/Cas9 של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים ליישומי ריפוי גנטי
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אופטימלי של תרבית גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPC) לחריטה חזקה של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.
Abstract
CRISPR/Cas9 הוא כלי רב-תכליתי ויעיל ביותר לעריכת גנים שאומץ באופן נרחב לתיקון מוטציות גנטיות שונות. ההיתכנות של מניפולציה גנטית של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) במבחנה הופכת את HSPCs לתא מטרה אידיאלי לריפוי גנטי. עם זאת, HSPCs מאבדים באופן מתון את פוטנציאל החריטה והריבוי שלהם בתרבות ex vivo . במחקר הנוכחי מתוארים תנאי תרבית אידיאליים המשפרים את השתלת HSPC ומייצרים מספר גדל והולך של תאים מהונדסים גנטית in vivo. הדו”ח הנוכחי מציג תנאים אופטימליים בתרבית מבחנה, כולל סוג המדיה של התרבית, תוספת קוקטיילים ייחודית של מולקולות קטנות, ריכוז ציטוקינים, צלחות תרביות תאים וצפיפות תרבית. בנוסף לכך, הליך עריכת גנים ממוטב של HSPC, יחד עם אימות אירועי עריכת הגנים, מסופקים. לצורך אימות in vivo , מוצגים עירוי HSPCs בעריכה גנטית וניתוח לאחר חריטה במקבלי עכברים. התוצאות הראו כי מערכת התרבית הגבירה את התדירות של HSCs תפקודיים במבחנה, וכתוצאה מכך השתלה חזקה של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.
Introduction
חוסר הנגישות לתורמים תואמי אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) במסגרות השתלה אלוגניות והפיתוח המהיר של כלי הנדסה גנטית רב-תכליתיים ובטוחים ביותר הופכים את השתלת תאי הגזע ההמטופוייטיים האוטולוגיים (HSCT) לאסטרטגיית טיפול מרפאת בהפרעות הדם התורשתיות 1,2. טיפול גנטי אוטולוגי בגזע המטופויאטי ובתאי אב (HSPC) כולל איסוף של HSPCs של חולים, מניפולציה גנטית, תיקון מוטציות הגורמות למחלות והשתלת HSPCs מתוקנים גנטית לחולה 3,4. עם זאת, התוצאה המוצלחת של הטיפול הגנטי מסתמכת על איכות השתל המהונדס גנטית. שלבי מניפולציית הגנים ותרביית ex vivo של HSPCs משפיעים על איכות השתל על ידי הפחתת התדירות של תאי גזע המטופויאטיים ארוכי טווח (LT-HSCs), מה שמחייב עירוי של מינונים גדולים של HSPCs שעברו מניפולציה גנטית 2,5,6.
מספר מולקולות קטנות, כולל SR1 ו-UM171, משמשות כיום להרחבת HSPCs בדם טבוריבעוצמה של 7,8. עבור HSPCs בוגרים, בשל תפוקת התאים הגבוהה יותר המתקבלת בגיוס, אין צורך בהרחבה חזקה. עם זאת, שמירה על הגבעול של HSPCs מבודדים בתרבית ex vivo היא חיונית עבור יישומי הטיפול הגנטי שלה. לכן, גישה המתמקדת בהעשרת תרבית של תאי גזע המטופויאטיים (HSCs) מפותחת באמצעות שילוב של מולקולות קטנות: רזברטרול, UM729 ו-SR1 (RUS)7. תנאי התרבית הממוטבים של HSPC מקדמים את העשרת תאי ה-HSCs, וכתוצאה מכך את התדירות המוגברת של תאי HSCs מהונדסים גנטית in vivo, ומפחיתים את הצורך במניפולציה של גנים במינונים גדולים של HSPCs, מה שמקל על גישות חסכוניות לטיפול גנטי8.
כאן מתואר פרוטוקול מקיף לתרבית HSPCs, יחד עם עירוי וניתוח של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
התוצאה המוצלחת של טיפול גנטי HSPC מסתמכת בעיקר על האיכות והכמות של HSCs הניתנים להשתלה בשתל. עם זאת, התכונות התפקודיות של HSCs מושפעות מאוד במהלך שלב ההכנה של מוצרי ריפוי גנטי, כולל על ידי תרבית חוץ גופית ורעילות הקשורה להליך מניפולציה גנטית. כדי להתגבר על מגבלות אלה, זיהינו תנאי תרבות HSPCs אי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לצוות של מתקן ציטומטריה זרימה ומתקן בעלי חיים של CSCR. A. C. ממומן על ידי מלגת ICMR-SRF, K. V. K. ממומן על ידי מלגת DST-INSPIRE, ו- P. B. ממומן על ידי מלגת CSIR-JRF. עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו (מענק מס’ BT/PR26901/MED/31/377/2017 ו-BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
References
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major – From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
