CRISPR/Cas9 Genredigering av hematopoetiska stam- och stamceller för genterapitillämpningar
Summary
Detta protokoll beskriver en optimerad hematopoetisk stam- och stamcellsodlingsprocedur (HSPC) för robust engraftment av genredigerade celler in vivo.
Abstract
CRISPR/Cas9 är ett mycket mångsidigt och effektivt genredigeringsverktyg som används i stor utsträckning för att korrigera olika genetiska mutationer. Genomförbarheten av genmanipulation av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) in vitro gör HSPC till en idealisk målcell för genterapi. HSPCs förlorar dock måttligt sin engraftment och multilineage återbefolkningspotential i ex vivo-kulturen . I den aktuella studien beskrivs ideala odlingsförhållanden som förbättrar HSPC-engraftment och genererar ett ökat antal genmodifierade celler in vivo. Den aktuella rapporten visar optimerade in vitro-odlingsförhållanden , inklusive typen av odlingsmedier, unikt småmolekylärt cocktailtillskott, cytokinkoncentration, cellodlingsplattor och odlingstäthet. Utöver detta tillhandahålls en optimerad HSPC-genredigeringsprocedur, tillsammans med valideringen av genredigeringshändelserna. För in vivo-validering visas den genredigerade HSPCs-infusionen och post-engraftment-analysen hos musmottagare. Resultaten visade att odlingssystemet ökade frekvensen av funktionella HSC in vitro, vilket resulterade i robust engraftment av genredigerade celler in vivo.
Introduction
Otillgängligheten för humant leukocytantigen (HLA) -matchade givare i allogena transplantationsmiljöer och den snabba utvecklingen av mycket mångsidiga och säkra gentekniska verktyg gör autolog hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) till en botande behandlingsstrategi för de ärftliga blodsjukdomarna 1,2. Autolog hematopoietisk stam- och stamcellsgenterapi (HSPC) involverar insamling av patienternas HSPC, genetisk manipulation, korrigering av sjukdomsframkallande mutationer och transplantation av genkorrigerade HSPC till patienten 3,4. Det framgångsrika resultatet av genterapin är dock beroende av kvaliteten på det transplanterbara genmodifierade transplantatet. Genmanipulationsstegen och ex vivo-odlingen av HSPC påverkar transplantatets kvalitet genom att minska frekvensen av långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC), vilket kräver infusion av stora doser av genmanipulerade HSPCs 2,5,6.
Flera små molekyler, inklusive SR1 och UM171, används för närvarande för att expandera HSPCs i navelsträngsblod robust 7,8. För vuxna HSPC: er, på grund av det högre cellutbytet som erhålls vid mobilisering, krävs inte robust expansion. Att behålla stammen hos isolerade HSPCs i ex vivo-odling är dock avgörande för dess genterapitillämpningar. Därför utvecklas ett tillvägagångssätt som fokuserar på odlingsanrikning av hematopoetiska stamceller (HSC) med hjälp av en kombination av små molekyler: Resveratrol, UM729 och SR1 (RUS)7. De optimerade HSPC-odlingsförhållandena främjar anrikningen av HSC: er, vilket resulterar i ökad frekvens av genmodifierade HSC in vivo och minskar behovet av genmanipulation av stora doser av HSPC, vilket underlättar kostnadseffektiva genterapimetoder8.
Här beskrivs ett omfattande protokoll för HSPCs-odling, tillsammans med infusion och analys av genredigerade celler in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det framgångsrika resultatet av HSPC-genterapi är huvudsakligen beroende av kvaliteten och kvantiteten av engraferbara HSC i transplantatet. De funktionella egenskaperna hos HSC påverkas emellertid starkt under den förberedande fasen av genterapiprodukter, inklusive genom in vitro-odling och toxicitet associerad med genmanipulationsförfarandet. För att övervinna dessa begränsningar har vi identifierat idealiska HSPCs-odlingsförhållanden som behåller stammen hos CD34 + CD133 + CD90 +</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill uppmärksamma personalen på flödescytometrianläggningen och djuranläggningen i CSCR. A. C. finansieras av ett ICMR-SRF-stipendium, K. V. K. finansieras av ett DST-INSPIRE-stipendium och P. B. finansieras av ett CSIR-JRF-stipendium. Detta arbete finansierades av Institutionen för bioteknik, Indiens regering (bidrag nr BT/PR26901/MED/31/377/2017 och BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
References
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major – From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
