CRISPR/Cas9-Gen-Editing von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für gentherapeutische Anwendungen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes hämatopoetisches Stamm- und Vorläuferzell-Kulturverfahren (HSPC) für die robuste Anpflanzung von geneditierten Zellen in vivo.
Abstract
CRISPR/Cas9 ist ein äußerst vielseitiges und effizientes Gen-Editing-Tool, das häufig zur Korrektur verschiedener genetischer Mutationen eingesetzt wird. Die Machbarkeit der Genmanipulation von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) in vitro macht HSPCs zu einer idealen Zielzelle für die Gentherapie. HSPCs verlieren jedoch in Ex-vivo-Kultur moderat ihr Engraftment- und Multilineage-Repopulationspotenzial. In der vorliegenden Studie werden ideale Kulturbedingungen beschrieben, die das HSPC-Engraftment verbessern und eine erhöhte Anzahl genmodifizierter Zellen in vivo erzeugen. Der aktuelle Bericht zeigt optimierte In-vitro-Kulturbedingungen , einschließlich der Art der Kulturmedien, der einzigartigen Ergänzung mit niedermolekularen Cocktails, der Zytokinkonzentration, der Zellkulturplatten und der Kulturdichte. Darüber hinaus werden ein optimiertes HSPC-Gen-Editing-Verfahren sowie die Validierung der Gen-Editing-Ereignisse bereitgestellt. Für die In-vivo-Validierung werden die geneditierte HSPC-Infusion und die Post-Engraftment-Analyse bei Mausempfängern angezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Kultursystem die Häufigkeit funktioneller HSZ in vitro erhöhte, was zu einer robusten Anpflanzung von geneditierten Zellen in vivo führte.
Introduction
Die Unzugänglichkeit zu humanen Leukozytenantigen (HLA)-passenden Spendern in allogenen Transplantationsumgebungen und die rasche Entwicklung äußerst vielseitiger und sicherer gentechnischer Werkzeuge machen die autologe hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) zu einer kurativen Behandlungsstrategie für erbliche Blutkrankheiten 1,2. Die autologe hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzell-Gentherapie (HSPC) umfasst die Sammlung von HSPCs der Patienten, genetische Manipulation, Korrektur krankheitsverursachender Mutationen und Transplantation genkorrigierter HSPCs in den Patienten 3,4. Das erfolgreiche Ergebnis der Gentherapie hängt jedoch von der Qualität des transplantierbaren, genmodifizierten Transplantats ab. Die Genmanipulationsschritte und die Ex-vivo-Kultur von HSPCs beeinflussen die Qualität des Transplantats, indem sie die Häufigkeit von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) verringern, was die Infusion großer Dosen genmanipulierter HSPCs erfordert 2,5,6.
Mehrere kleine Moleküle, darunter SR1 und UM171, werden derzeit verwendet, um Nabelschnurblut-HSPCs robust zu expandieren 7,8. Für adulte HSPCs ist aufgrund der höheren Zellausbeute, die bei der Mobilisierung erzielt wird, keine robuste Expansion erforderlich. Die Beibehaltung der Stammzellen isolierter HSPCs in Ex-vivo-Kultur ist jedoch entscheidend für ihre Gentherapieanwendungen. Daher wird ein Ansatz entwickelt, der sich auf die Kulturanreicherung von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) konzentriert, wobei eine Kombination kleiner Moleküle verwendet wird: Resveratrol, UM729 und SR1 (RUS)7. Die optimierten HSPC-Kulturbedingungen fördern die Anreicherung von HSCs, was zu einer erhöhten Häufigkeit genmodifizierter HSCs in vivo führt und die Notwendigkeit reduziert, große Dosen von HSPCs genmanipulieren zu müssen, was kostengünstige Gentherapieansätze ermöglicht8.
Hier wird ein umfassendes Protokoll für die HSPC-Kultur beschrieben, zusammen mit der Infusion und Analyse von geneditierten Zellen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das erfolgreiche Ergebnis der HSPC-Gentherapie hängt hauptsächlich von der Qualität und Quantität der transplantierbaren HSZ im Transplantat ab. Die funktionellen Eigenschaften von HSZ werden jedoch während der Vorbereitungsphase von Gentherapieprodukten stark beeinträchtigt, einschließlich durch In-vitro-Kultur und Toxizität im Zusammenhang mit dem Genmanipulationsverfahren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ideale HSPC-Kulturbedingungen identifiziert, die die Stammheit von CD34+<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Durchflusszytometrie-Einrichtung und der Tiereinrichtung des CSCR würdigen. A. C. wird durch ein ICMR-SRF-Stipendium finanziert, K. V. K. wird durch ein DST-INSPIRE-Stipendium und P. B. durch ein CSIR-JRF-Stipendium finanziert. Diese Arbeit wurde vom Department of Biotechnology der indischen Regierung finanziert (Fördernummer BT/PR26901/MED/31/377/2017 und BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
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