遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集
Summary
本プロトコルは、 in vivoでの遺伝子編集細胞の堅牢な生着のために最適化された造血幹および前駆細胞(HSPC)培養手順を記載しています。
Abstract
CRISPR/Cas9は、さまざまな遺伝子変異を修正するために広く採用されている、汎用性が高く効率的な遺伝子編集ツールです。造血幹および前駆細胞(HSPC)のin vitro での遺伝子操作の実現可能性により、HSPCは遺伝子治療の理想的な標的細胞になります。しかし、HSPCは、 ex vivo 培養において生着および多系統再増殖の可能性を適度に失う。本研究では、HSPCの生着を改善し、 in vivoで遺伝子改変細胞の数を増加させる理想的な培養条件について説明します。現在のレポートには、培地の種類、独自の低分子カクテルの補給、サイトカイン濃度、細胞培養プレート、培養密度など、最適化された in vitro 培養条件が表示されます。それに加えて、最適化されたHSPC遺伝子編集手順と、遺伝子編集イベントの検証が提供されます。 in vivo 検証のために、マウスレシピエントにおける遺伝子編集HSPC注入および生着後分析が表示されます。結果は、培養系がin vitroで機能的な造血幹細胞の頻度を増加させ、その結果 、in vivoで遺伝子編集細胞の強力な生着をもたらすことを実証しました。
Introduction
同種異系移植環境におけるヒト白血球抗原(HLA)マッチングドナーへのアクセスの難しさと、汎用性が高く安全な遺伝子工学ツールの急速な開発により、自家造血幹細胞移植(HSCT)は遺伝性血液疾患の治癒的治療戦略となっています1,2。自家造血幹および前駆細胞(HSPC)遺伝子治療には、患者のHSPCの収集、遺伝子操作、疾患の原因となる突然変異の修正、および遺伝子修正されたHSPCの患者への移植が含まれます3,4。ただし、遺伝子治療の成功結果は、移植可能な遺伝子改変移植片の品質に依存しています。HSPCの遺伝子操作ステップとエクスビボ培養は、長期造血幹細胞(LT-HSC)の頻度を低下させることにより移植片の品質に影響を与え、大量の遺伝子操作HSPCの注入を必要とします2,5,6。
SR1およびUM171を含むいくつかの低分子は、現在、臍帯血HSPCを堅牢に拡張するために使用されています7,8。成人HSPCの場合、動員で得られる細胞収量が高いため、堅牢な拡張は必要ありません。しかし、分離されたHSPCの幹細胞性をex vivo培養で保持することは、その遺伝子治療アプリケーションにとって非常に重要です。そこで、レスベラトロール、UM729、SR1(RUS)7の低分子を組み合わせて造血幹細胞(HSC)の培養濃縮に焦点を当てたアプローチを開発しています。最適化されたHSPC培養条件は、造血幹細胞の濃縮を促進し、その結果、in vivoでの遺伝子改変造血幹細胞の頻度が増加し、大量のHSPCを遺伝子操作する必要性を減らし、費用対効果の高い遺伝子治療アプローチを促進します8。
ここでは、HSPC培養のための包括的なプロトコルを、 in vivoでの遺伝子編集細胞の注入と分析とともに説明します。
Protocol
免疫不全マウスでのin vivo実験は、インドのベロールにあるクリスチャン医科大学の研究所動物倫理委員会(IAEC)によって承認され、それに従って実施されました。顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)に動員された末梢血サンプルは、治験審査委員会(IRB)の承認を得た後、インフォームドコンセントで健康なヒトドナーから収集されました。 1.末梢血単核球(PBMNC)の単離?…
Representative Results
本研究では、エクスビボ培養におけるCD34 + CD133 + CD90 + HSCの保持を促進する理想的なHSPC培養条件を特定します。遺伝子改変造血幹細胞の増強とともに造血幹細胞の培養濃縮を実証するために、PBMNC単離、CD34+細胞精製、培養、遺伝子編集、移植、生着の特性評価、およびin vivoでの遺伝子改変細胞のための最適化された手順が提供されています(<stron…
Discussion
HSPC遺伝子治療の成功は、主に移植片中の生着可能な造血幹細胞の質と量に依存しています。ただし、HSCの機能特性は、遺伝子操作手順に関連するin vitro培養や毒性など、遺伝子治療製品の準備段階で大きな影響を受けます。これらの制限を克服するために、エクスビボ培養でCD34 + CD133 + CD90 + HSCのステム性を保持する理想的なHSPC培養条件を特定しました?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、CSCRのフローサイトメトリー施設および動物施設のスタッフに感謝したい。A.C.はICMR-SRFフェローシップ、K.V.K.はDST-INSPIREフェローシップ、P.B.はCSIR-JRFフェローシップから資金提供を受けています。 この研究は、インド政府のバイオテクノロジー省によって資金提供されました(助成金番号BT / PR26901 / MED/ 31/377 / 2017およびBT / PR31616 / MED/ 31/408/2019)
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
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Cite This Article
Venkatesan, V., Christopher, A. C., Karuppusamy, K. V., Babu, P., Alagiri, M. K. K., Thangavel, S. CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications. J. Vis. Exp. (186), e64064, doi:10.3791/64064 (2022).