Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica
Summary
O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.
Abstract
CRISPR/Cas9 é uma ferramenta de edição de genes altamente versátil e eficiente adotada amplamente para corrigir várias mutações genéticas. A viabilidade da manipulação gênica de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) in vitro torna os HSPCs uma célula-alvo ideal para a terapia gênica. No entanto, os HSPCs perdem moderadamente seu potencial de enxerto e repovoamento de multilinhagem em cultura ex vivo. No presente estudo, são descritas condições ideais de cultura que melhoram o enxerto de HSPC e geram um aumento do número de células geneticamente modificadas in vivo. O relatório atual exibe condições de cultura in vitro otimizadas, incluindo o tipo de meio de cultura, suplementação exclusiva de coquetéis de pequenas moléculas, concentração de citocinas, placas de cultura celular e densidade de cultura. Além disso, um procedimento otimizado de edição de genes do HSPC, juntamente com a validação dos eventos de edição de genes, são fornecidos. Para validação in vivo , a infusão de HSPCs editados por genes e a análise pós-enxerto em receptores de camundongos são exibidas. Os resultados demonstraram que o sistema de cultura aumentou a frequência de HSCs funcionais in vitro, resultando em enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.
Introduction
A inacessibilidade a doadores pareados com antígeno leucocitário humano (HLA) em ambientes de transplante alogênico e o rápido desenvolvimento de ferramentas de engenharia genética altamente versáteis e seguras tornam o transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TCTH) uma estratégia de tratamento curativo para os hemodistúrbios hereditários 1,2. A terapia gênica autóloga com células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) envolve a coleta de HSPCs dos pacientes, manipulação genética, correção de mutações causadoras de doenças e transplante de HSPCs corrigidos por genes no paciente 3,4. No entanto, o resultado bem-sucedido da terapia gênica depende da qualidade do enxerto modificado por genes transplantáveis. As etapas de manipulação gênica e a cultura ex vivo de HSPCs afetam a qualidade do enxerto, diminuindo a frequência de células-tronco hematopoiéticas de longo prazo (LT-HSCs), necessitando da infusão de grandes doses de HSPCs manipulados por genes 2,5,6.
Várias moléculas pequenas, incluindo SR1 e UM171, estão sendo empregadas atualmente para expandir robustamente os HSPCs do sangue do cordão umbilical 7,8. Para HSPCs adultos, devido ao maior rendimento celular obtido na mobilização, não é necessária expansão robusta. No entanto, a retenção da haste de HSPCs isolados em cultura ex vivo é crucial para suas aplicações de terapia gênica. Portanto, uma abordagem com foco no enriquecimento cultural de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) é desenvolvida utilizando uma combinação de pequenas moléculas: Resveratrol, UM729 e SR1 (RUS)7. As condições de cultura otimizadas do HSPC promovem o enriquecimento das HSCs, resultando no aumento da frequência de HSCs modificadas por genes in vivo, e reduzem a necessidade de manipulação gênica de grandes doses de HSPCs, facilitando abordagens de terapia gênica custo-efetivas8.
Aqui, um protocolo abrangente para a cultura de HSPCs é descrito, juntamente com a infusão e análise de células editadas por genes in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O resultado bem-sucedido da terapia gênica com HSPC depende predominantemente da qualidade e quantidade de HSCs enxertáveis no enxerto. No entanto, as propriedades funcionais das HSCs são altamente afetadas durante a fase preparatória dos produtos de terapia gênica, inclusive pela cultura in vitro e toxicidade associada ao procedimento de manipulação gênica. Para superar essas limitações, identificamos condições ideais de cultura de HSPCs que retêm a caule de HSCs CD34+CD133+CD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores querem reconhecer a equipe da instalação de citometria de fluxo e da instalação animal da CSCR. A. C. é financiado por uma bolsa ICMR-SRAF, K. V. K. é financiado por uma bolsa DST-INSPIRE e P. B. é financiado por uma bolsa CSIR-JRF. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia (subvenção n.º BT/PR26901/MED/31/377/2017 e BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
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