Detta protokoll beskriver en optimerad hematopoetisk stam- och stamcellsodlingsprocedur (HSPC) för robust engraftment av genredigerade celler in vivo.
CRISPR/Cas9 är ett mycket mångsidigt och effektivt genredigeringsverktyg som används i stor utsträckning för att korrigera olika genetiska mutationer. Genomförbarheten av genmanipulation av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) in vitro gör HSPC till en idealisk målcell för genterapi. HSPCs förlorar dock måttligt sin engraftment och multilineage återbefolkningspotential i ex vivo-kulturen . I den aktuella studien beskrivs ideala odlingsförhållanden som förbättrar HSPC-engraftment och genererar ett ökat antal genmodifierade celler in vivo. Den aktuella rapporten visar optimerade in vitro-odlingsförhållanden , inklusive typen av odlingsmedier, unikt småmolekylärt cocktailtillskott, cytokinkoncentration, cellodlingsplattor och odlingstäthet. Utöver detta tillhandahålls en optimerad HSPC-genredigeringsprocedur, tillsammans med valideringen av genredigeringshändelserna. För in vivo-validering visas den genredigerade HSPCs-infusionen och post-engraftment-analysen hos musmottagare. Resultaten visade att odlingssystemet ökade frekvensen av funktionella HSC in vitro, vilket resulterade i robust engraftment av genredigerade celler in vivo.
Otillgängligheten för humant leukocytantigen (HLA) -matchade givare i allogena transplantationsmiljöer och den snabba utvecklingen av mycket mångsidiga och säkra gentekniska verktyg gör autolog hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) till en botande behandlingsstrategi för de ärftliga blodsjukdomarna 1,2. Autolog hematopoietisk stam- och stamcellsgenterapi (HSPC) involverar insamling av patienternas HSPC, genetisk manipulation, korrigering av sjukdomsframkallande mutationer och transplantation av genkorrigerade HSPC till patienten 3,4. Det framgångsrika resultatet av genterapin är dock beroende av kvaliteten på det transplanterbara genmodifierade transplantatet. Genmanipulationsstegen och ex vivo-odlingen av HSPC påverkar transplantatets kvalitet genom att minska frekvensen av långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC), vilket kräver infusion av stora doser av genmanipulerade HSPCs 2,5,6.
Flera små molekyler, inklusive SR1 och UM171, används för närvarande för att expandera HSPCs i navelsträngsblod robust 7,8. För vuxna HSPC: er, på grund av det högre cellutbytet som erhålls vid mobilisering, krävs inte robust expansion. Att behålla stammen hos isolerade HSPCs i ex vivo-odling är dock avgörande för dess genterapitillämpningar. Därför utvecklas ett tillvägagångssätt som fokuserar på odlingsanrikning av hematopoetiska stamceller (HSC) med hjälp av en kombination av små molekyler: Resveratrol, UM729 och SR1 (RUS)7. De optimerade HSPC-odlingsförhållandena främjar anrikningen av HSC: er, vilket resulterar i ökad frekvens av genmodifierade HSC in vivo och minskar behovet av genmanipulation av stora doser av HSPC, vilket underlättar kostnadseffektiva genterapimetoder8.
Här beskrivs ett omfattande protokoll för HSPCs-odling, tillsammans med infusion och analys av genredigerade celler in vivo.
Det framgångsrika resultatet av HSPC-genterapi är huvudsakligen beroende av kvaliteten och kvantiteten av engraferbara HSC i transplantatet. De funktionella egenskaperna hos HSC påverkas emellertid starkt under den förberedande fasen av genterapiprodukter, inklusive genom in vitro-odling och toxicitet associerad med genmanipulationsförfarandet. För att övervinna dessa begränsningar har vi identifierat idealiska HSPCs-odlingsförhållanden som behåller stammen hos CD34 + CD133 + CD90 +</s…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill uppmärksamma personalen på flödescytometrianläggningen och djuranläggningen i CSCR. A. C. finansieras av ett ICMR-SRF-stipendium, K. V. K. finansieras av ett DST-INSPIRE-stipendium och P. B. finansieras av ett CSIR-JRF-stipendium. Detta arbete finansierades av Institutionen för bioteknik, Indiens regering (bidrag nr BT/PR26901/MED/31/377/2017 och BT/PR31616/MED/31/408/2019)
4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
DMSO | MPBIO | 219605590 | |
DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
Infrared lamp | MURPHY | – | |
Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
Ketamine | KETMIN 50 | – | |
Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
sgRNA | SYNTHEGO | - | |
SPINWIN | TARSON | 1020 | |
StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |