生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成
Summary
無細胞再構成は、細胞骨格アセンブリを理解するための重要なツールであり、過去10年間の研究は、最小限の系におけるセプチンダイナミクスを研究するためのアプローチを確立した。ここでは、異なる膜コンテキストでセプチンアセンブリを観察するための3つの相補的な方法、すなわち平面二重層、球状支持体、およびロッド支持体を提示する。
Abstract
ほとんどの細胞は、基本的な細胞プロセスを実行するために、その形状を感知し、変化させることができます。多くの真核生物において、セプチン細胞骨格は、サイトカイン、分極成長、および遊走のような形状変化を調整する上で不可欠な構成要素である。セプチンは、多様な高次構造を形成するために集合するフィラメント形成タンパク質であり、多くの場合、原形質膜のさまざまな領域、特にミクロンスケールの正の曲率の領域に見られる。 インビボ でのセプチン集合のプロセスをモニタリングすることは、細胞における光学顕微鏡検査の限界、ならびに膜および細胞骨格要素の両方との相互作用の複雑さによって妨げられ、生体系におけるセプチン動態を定量化することを困難にしている。幸いなことに、過去10年間に、セプチンの集合を制御するメカニズムを高い空間的および時間的分解能で解剖するために、無細胞系でセプチン細胞骨格を再構成することにおいて大きな進歩があった。セプチン集合のコアステップには、セプチンヘテロオリゴマーの膜との会合および解離、フィラメントへの重合、およびフィラメント間の相互作用を介した高次構造の形成が含まれる。ここでは、異なるコンテキストでセプチンアセンブリを観察するための3つの方法、すなわち平面二重層、球状支持体、およびロッド支持を提示する。これらの方法は、集合のさまざまな段階におけるセプチンの生物物理学的パラメータを決定するために使用することができる:膜を結合する単一の八量体として、フィラメントとして、およびフィラメントの集合体として。これらのパラメータを曲率サンプリングおよび優先吸着の測定と組み合わせて使用し、曲率センシングがさまざまな長さおよび時間スケールでどのように動作するかを理解します。
Introduction
細胞の形状とその内部区画の多くは、それらを囲む脂質膜に依存しています。膜は粘弾性構造であり、タンパク質との相互作用、脂質選別、および作用する内的および外的力を介して変形して様々な形状を生成することができる1、2、3、4。これらの形状は、しばしば膜曲率の観点から記述される。細胞は、特定の膜曲率を優先的に組み立てることができる多様なタンパク質スイートを使用して、細胞輸送、サイトカイン、および遊走を含むプロセスに対する定義された時空間制御を保証する5,6。膜における細胞機構のダイナミクスは、時間と空間分解能と細胞の健康とのバランスをとることが困難であるため、観察することが著しく困難である。超解像技術はそのような構造の詳細なビューを提供することができますが、ほとんどの機械の組み立て/分解の時間スケールに適さない長い取得を必要とします。さらに、ネイティブ環境におけるこれらのアセンブリの分子の複雑さと、単一のコンポーネントが果たすことができる多数の役割により、最小限の再構成システムは分子の機能的能力を研究するための貴重なツールになります。
最小限の膜模倣体は、細胞外の膜特性およびタンパク質 – 膜相互作用を研究するために開発されている。膜模倣体は、リポソームまたは巨大な単層小胞などの自立脂質二重層から、支持脂質二重層(SLB)までさまざまである7、8、9、10。SLBは、下層の支持体に固定された生体模倣膜であり、典型的には、ガラス、マイカ、またはシリカ11、12から構成される。平面表面、球体、棒状体、さらには起伏のある基板またはマイクロパターン化された基質を含む様々な形状を使用して、凹面曲率と凸曲率の両方で同時にタンパク質膜相互作用をプローブすることができる1 3,14,15,16,17,18.二重層形成は、親水性表面への小胞吸着から始まり、続いて融合および破裂して連続的な二重層を形成する(図1)19。支持された二重層は、光および電子顕微鏡に特に適しており、細胞でしばしば達成可能なよりも優れた時間と空間分解能の両方を提供する。湾曲したSLBは、特に、著しい膜変形がない場合にタンパク質の曲率感度をプローブする魅力的な手段を提供し、自立系では分離が不可能な曲率センシングと曲率誘導を区別することができます。
セプチンは、正に湾曲した膜上に集合する能力でよく知られているフィラメント形成細胞骨格タンパク質のクラスである6,18,20。酵母における細胞周期の過程で、セプチンはリングに集合し、それぞれ芽の出現およびサイトカインに関連する砂時計および二重リング構造を形成するために再配列しなければならない21。プラチナレプリカ電子顕微鏡を使用して、さまざまな細胞周期段階22でセプチン構造を観察する美しい研究が行われてきましたが、酵母の光学顕微鏡を使用してセプチンアセンブリを経時的に観察することは、限られた空間分解能で満たされました。透過型電子顕微鏡(TEM)によって可視化された脂質単層を用いたセプチンに関する以前の研究は、環、束、およびガウゼ23などのいくつかの興味深いセプチン構造を再構成することができた。しかしながら、EM技術は、蛍光顕微鏡法とは異なり、その時間分解能において同様に制限される。セプチンアセンブリのマルチスケールプロセスの動力学パラメータをよりよく解決するために、我々は、膜形状、サンプル条件、およびイメージングモダリティを慎重に制御できる支持された膜模倣体に目を向けた。
ここで説明するプロトコルは、平面または湾曲したSLB、精製タンパク質、および顕微鏡技術の組み合わせを使用する。定量的蛍光共焦点顕微鏡および全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を使用して、様々な膜曲率へのバルクタンパク質結合の両方を測定し、ならびに単一分子の結合動態を測定した。さらに、このプロトコルは、異なる膜曲率上のタンパク質超微細構造を調べるために走査型電子顕微鏡(SEM)と共に使用されるように適合されている。これらのプロトコルの焦点はセプチン細胞骨格にありますが、プロトコルは簡単に変更して、読者が興味深いと感じるタンパク質の曲率感度を調べることができます。さらに、エンドサイトーシスや小胞性トラフィッキングなどの分野で働いている人は、これらの技術が多タンパク質複合体の曲率依存性アセンブリをプローブするのに有用であると感じるかもしれません。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞膜は、多くの異なる形状、曲率、および物理化学的特性を帯びる。細胞がマイクロメートルスケールのアセンブリを構築するナノメートルスケールの機械を研究するためには、膜模倣体の最小限の再構成システムを設計する必要がある。このプロトコルは、膜曲率と組成の両方を正確に制御する技術を提示しながら、広く利用可能な顕微鏡技術を使用して定量的な蛍光測定を簡単に行う?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(NIH)グラント番号によって支援されました。R01 GM-130934と国立科学財団(NSF)グラントMCB-2016022。B.N.C.、E.J.D.V.、K.S.C.は、国立総合医科学研究所からの助成金T32 GM119999の助成金によって部分的に支援されました。
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
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