Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Summary

A reconstituição livre de células tem sido uma ferramenta fundamental para entender a montagem do citoesqueleto, e o trabalho na última década estabeleceu abordagens para estudar a dinâmica dos septins em sistemas mínimos. Aqui apresentados estão três métodos complementares para observar a montagem de septina em diferentes contextos de membrana: bicamadas planares, suportes esféricos e suportes de hastes.

Abstract

A maioria das células pode sentir e mudar sua forma para realizar processos celulares fundamentais. Em muitos eucariotes, o citoesqueleto de septina é um componente integral na coordenação de mudanças de forma como citocinese, crescimento polarizado e migração. Os septinas são proteínas formadoras de filamentos que se reúnem para formar diversas estruturas de alta ordem e, em muitos casos, são encontradas em diferentes áreas da membrana plasmática, mais notavelmente em regiões de curvatura positiva em escala de mícon. O monitoramento do processo de montagem de septina in vivo é dificultado pelas limitações da microscopia de luz nas células, bem como pela complexidade das interações com membranas e elementos citoesqueléticos, dificultando a quantificação da dinâmica do septino nos sistemas vivos. Felizmente, houve progressos substanciais na última década na reconstituição do citoesqueleto de septina em um sistema livre de células para dissecar os mecanismos que controlam a montagem de septinas em altas resoluções espaciais e temporais. Os passos centrais da montagem de septina incluem associação de heterooligomeres de septina e dissociação com a membrana, polimerização em filamentos, e a formação de estruturas de alta ordem através de interações entre filamentos. Aqui, apresentamos três métodos para observar a montagem de septina em diferentes contextos: bicamadas de planar, suportes esféricos e suportes de hastes. Esses métodos podem ser usados para determinar os parâmetros biofísicos dos septinos em diferentes estágios de montagem: como octamers únicos que ligam a membrana, como filamentos, e como conjuntos de filamentos. Utilizamos esses parâmetros emparelhados com medidas de amostragem de curvatura e adsorção preferencial para entender como o sensor de curvatura opera em uma variedade de escalas de comprimento e tempo.

Introduction

As formas das células e muitos de seus compartimentos internos dependem das membranas lipídicas que as cercam. As membranas são estruturas viscoelásticas que podem ser deformadas através de interações com proteínas, triagem lipídica e atuação de forças internas e externas para gerar uma variedade de formas 1,2,3,4. Essas formas são frequentemente descritas em termos de curvatura de membrana. As células utilizam um conjunto diversificado de proteínas capazes de se reunir preferencialmente, ou “sensoriamento”, curvaturas de membrana específicas para garantir o controle espátula-temporal definido sobre processos como tráfico celular, citocinas e migração ^5,6. A dinâmica do maquinário celular na membrana é notavelmente difícil de observar devido à dificuldade de equilibrar o tempo e a resolução espacial com a saúde celular. Embora as técnicas de superrespeição possam oferecer uma visão detalhada de tais estruturas, elas exigem aquisições longas que não são favoráveis às escalas de tempo de montagem/desmontagem para a maioria das máquinas. Além disso, a complexidade molecular desses conjuntos em seu ambiente nativo e a multiplicidade de papéis que um único componente pode desempenhar fazem dos sistemas mínimos de reconstituição uma ferramenta valiosa para estudar a capacidade funcional das moléculas.

A mímética de membrana mínima foi desenvolvida para estudar propriedades de membrana e interações proteína-membrana fora da célula. Os miméticos de membrana variam de bicamadas lipídicas de pé livre, como lipossomos ou vesículas unilamellar gigantes, até bicamadas lipídicas suportadas (SLBs)7,8,9,10. SLBs são membranas biomiméticas ancoradas ao suporte subjacente, tipicamente composto de vidro, mica ou sílica ^11,12. Uma variedade de geometrias pode ser usada, incluindo superfícies planares, esferas, hastes e até substratos ondulantes ou micropatterados para sondar interações proteína-membrana em curvaturas côncavas e convexas simultaneamente¹ 3,14,15,16,17,18 . A formação de bicamadas começa com a adsorção de vesículas em uma superfície hidrofílica, seguida de fusão e ruptura para formar uma bicamada contínua (Figura 1)¹⁹. Bicamadas suportadas são particularmente favoráveis à microscopia de luz e elétrons, fornecendo melhor tempo e resolução espacial do que muitas vezes é alcançável nas células. Os SLBs curvos fornecem especialmente um meio atraente para sondar a sensibilidade à curvatura da proteína na ausência de deformação significativa da membrana, permitindo que se distingue entre sensor de curvatura e indução de curvatura, que muitas vezes são impossíveis de separar em sistemas autônomos.

Os septinos são uma classe de proteínas citoesqueletal formadoras de filamentos bem conhecidas por sua capacidade de se reunir em membranas positivamente curvas ^6,18,20. Ao longo do ciclo celular na levedura, os septinos se reúnem em um anel e devem reorganizar-se para formar as estruturas de ampulheta e anel duplo associadas ao surgimento de brotos e citocinese, respectivamente²¹. Embora belo trabalho tenha sido feito usando microscopia eletrônica de réplica de platina para observar a arquitetura de septina em diferentes estágios de ciclo celular²², assistir ao conjunto de septina ao longo do tempo usando microscopia de luz na levedura encontrou-se com resolução espacial limitada. Trabalhos anteriores em septinas usando monocamadas lipídicas visualizadas pela microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi capaz de reconstituir várias estruturas de septina interessantes, como anéis, feixes e gazes²³. No entanto, as técnicas EM também são limitadas em sua resolução temporal, ao contrário da microscopia de fluorescência. A fim de melhor resolver os parâmetros cinéticos do processo multies em escala da montagem de septina, recorremos a miméticas de membrana suportadas, onde podemos controlar cuidadosamente a geometria da membrana, as condições amostrais e a modalidade de imagem.

Os protocolos descritos aqui usam SLBs planar ou curvos, proteína purificada e uma combinação de técnicas de microscopia. A microscopia de fluorescência quantitativa e a microscopia total de fluorescência interna (TIRFM) foram utilizadas para medir tanto a ligação de proteína a granel em várias curvaturas de membrana, quanto para medir a cinética vinculante de moléculas únicas. Além disso, este protocolo foi adaptado para ser usado com microscopia eletrônica de varredura (SEM) para examinar a ultraestrutura proteica em diferentes curvaturas de membrana. Embora o foco desses protocolos esteja no citoesqueleto septino, os protocolos podem ser facilmente modificados para investigar a sensibilidade da curvatura de qualquer proteína que o leitor ache interessante. Além disso, aqueles que trabalham em áreas como endocitose ou tráfico vesicular podem achar essas técnicas úteis para sondar os conjuntos dependentes da curvatura de complexos multiprofissionais.

Protocol

NOTA: Formar bicamadas lipídicas suportadas requer a preparação de pequenas vesículas unilamellar monodisperadas (SUVs). Consulte um protocolo24 publicado anteriormente na formação de SUV. Resumidamente, todos os SUVs são formados por sônica de sonda por 12 min no total a 70% de amplitude através de períodos de sônica de 4 min seguidos por períodos de descanso de 2 min em água gelada. As soluções de SUV devem ser bem esclarecidas e monodisperadas em tamanho. As distribuições de ta…

Representative Results

Após a preparação de cada SLB, os septinos ou a proteína de interesse podem ser incubados com o suporte desejado e imageados via TIRFM, microscopia confocal ou SEM. Os resultados aqui apresentados utilizam septinas recombinantemente expressas e purificadas de E. coli17. Utilizando o TIRFM em SLBs planar, é possível determinar o comprimento dos filamentos e sua flexibilidade, medir os coeficientes de difusão e observar a montagem ao longo do tempo 28,29<…

Discussion

As membranas celulares assumem muitas formas diferentes, curvaturas e propriedades físico-químicas. Para estudar o maquinário em escala de nanômetros através do qual as células constroem conjuntos em escala de micrômetros, é necessário projetar sistemas mínimos de reconstituição de mimetéticas de membrana. Este protocolo apresenta técnicas que controlam precisamente a curvatura e a composição da membrana, permitindo ao usuário facilmente tomar medidas quantitativas de fluorescência usando técnicas de m…

Materials

0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural	Watson	137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes	USA Scientific	1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips	Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
Egg Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipids	810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade	VWR	16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer	VWR	11652
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-223EA
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191
Magnesium chloride	VWR	7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers	Matsunami	Discontinued	22×22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres	Bangs Laboratories, Inc.	Depends on size: SS0200*-SS0500*	Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive	Norland Thorlabs	NOA 68	Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide	Millipore Sigma	20816-12-0
Parafilm	VWR	52858-000
Plasma Cleaner	Plasma Etch	PE-25	Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride	VWR	0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm	VWR	64-0712
Sonicator bath	Branson	1510R-MT	Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI	Avanti Polar Lipids	840044
Tabletop centrifuge	Eppendorf	22331
UV Lamp	Spectroline	ENF-260C	115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper	VWR	28455-030	42.5 mm diameter, Grade GF/C