Rekonstitution af Septin-samling ved membraner for at studere biofysiske egenskaber og funktioner

Summary

Cellefri rekonstitution har været et vigtigt værktøj til at forstå cytoskeletsamlingen, og arbejdet i det sidste årti har etableret tilgange til at studere septindynamik i minimale systemer. Præsenteret her er tre komplementære metoder til at observere septinsamling i forskellige membrankontekster: plane dobbeltlag, sfæriske understøtninger og stangstøtter.

Abstract

De fleste celler kan sanse og ændre deres form for at udføre grundlæggende celleprocesser. I mange eukaryoter er septincytoskelettet en integreret komponent i koordinering af formændringer som cytokinese, polariseret vækst og migration. Septiner er filamentdannende proteiner, der samles for at danne forskellige højere ordensstrukturer og i mange tilfælde findes i forskellige områder af plasmamembranen, især i områder med mikronskala positiv krumning. Overvågning af processen med septinsamling in vivo hindres af begrænsningerne ved lysmikroskopi i celler samt kompleksiteten af interaktioner med både membraner og cytoskeletale elementer, hvilket gør det vanskeligt at kvantificere septindynamik i levende systemer. Heldigvis har der været betydelige fremskridt i det sidste årti med at rekonstituere septincytoskelettet i et cellefrit system for at dissekere de mekanismer, der styrer septinsamling ved høje rumlige og tidsmæssige opløsninger. Kernetrinnene i septinsamling inkluderer septin heterooligomerassocilation og dissociation med membranen, polymerisation i filamenter og dannelse af højere ordensstrukturer gennem interaktioner mellem filamenter. Her præsenterer vi tre metoder til at observere septinsamling i forskellige sammenhænge: plane dobbeltlag, sfæriske understøtninger og stangstøtter. Disse metoder kan anvendes til at bestemme de biofysiske parametre for septiner på forskellige stadier af samlingen: som enkeltoktomerer, der binder membranen, som filamenter og som samlinger af filamenter. Vi bruger disse parametre parret med målinger af krumningsprøvetagning og præferenceadsorption for at forstå, hvordan krumningsføling fungerer i forskellige længder og tidsskalaer.

Introduction

Cellernes former og mange af deres indre rum er afhængige af lipidmembranerne, der omgiver dem. Membraner er viskoelastiske strukturer, der kan deformeres gennem interaktioner med proteiner, lipidsortering og virkende interne og eksterne kræfter for at generere en række forskellige former 1,2,3,4. Disse former beskrives ofte med hensyn til membrankrumning. Celler bruger en forskelligartet række proteiner, der er i stand til fortrinsvis at samle sig på eller “sensere” bestemte membrankrumninger for at sikre defineret spatio-temporal kontrol over processer, herunder cellehandel, cytokinese og migration ^5,6. Dynamikken i cellemaskiner ved membranen er især vanskelig at observere på grund af vanskeligheden ved at afbalancere tid og rumlig opløsning med cellesundhed. Mens superopløsningsteknikker kan give et detaljeret overblik over sådanne strukturer, kræver de lange erhvervelser, der ikke er modtagelige for tidsskalaerne for montering / demontering for de fleste maskiner. Derudover gør den molekylære kompleksitet af disse samlinger i deres oprindelige miljø og de mange roller, som en enkelt komponent kan spille, minimale rekonstitutionssystemer til et værdifuldt værktøj til at studere molekylernes funktionelle kapacitet.

Minimal membranmimetik er udviklet til at studere membranegenskaber og protein-membran-interaktioner uden for cellen. Membranmimetik varierer fra fritstående lipiddobbeltlag, såsom liposomer eller gigantiske unilamellare vesikler, til understøttede lipiddobbeltlag (SLB’er)7,8,9,10. SLB’er er biomimetiske membraner forankret til underliggende støtte, typisk sammensat af glas, glimmer eller silica^11,12. En række geometrier kan anvendes, herunder plane overflader, kugler, stænger og endda bølgende eller mikropatternede substrater til at sonde protein-membraninteraktioner på både konkave og konvekse krumninger samtidigt¹ 3,14,15,16,17,18 . Dannelse af dobbeltlag begynder med vesikeladsorption på en hydrofil overflade efterfulgt af fusion og brud til dannelse af et kontinuerligt dobbeltlag (figur 1)¹⁹. Understøttede dobbeltlag er særligt modtagelige for lys og elektronmikroskopi, hvilket giver både bedre tid og rumlig opløsning, end det ofte kan opnås i celler. Buede SLB’er giver især et attraktivt middel til at undersøge proteinkrumningsfølsomhed i fravær af signifikant membrandeformation, hvilket gør det muligt at skelne mellem krumningsføler og krumningsinduktion, som ofte er umulige at adskille i fritstående systemer.

Septiner er en klasse af filamentdannende cytoskeletale proteiner, der er kendt for deres evne til at samle sig på positivt buede membraner ^6,18,20. I løbet af cellecyklussen i gær samles septiner til en ring og skal omarrangeres for at danne timeglas- og dobbeltringstrukturer forbundet med henholdsvis knopspiring og cytokinese²¹. Mens smukt arbejde er blevet udført ved hjælp af platin replika elektronmikroskopi til at observere septin arkitektur på varierende cellecyklus trin²², har se septin samling over tid ved hjælp af lysmikroskopi i gær mødt med begrænset rumlig opløsning. Tidligere arbejde med septiner ved hjælp af lipidmonolag visualiseret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) var i stand til at rekonstruere flere interessante septinstrukturer såsom ringe, bundter og gasbind²³. Imidlertid er EM-teknikker ligeledes begrænset i deres tidsmæssige opløsning, i modsætning til fluorescensmikroskopi. For bedre at løse de kinetiske parametre for septinsamlingsprocessen i flere skalaer vendte vi os til understøttet membranmimetik, hvor man omhyggeligt kan kontrollere membrangeometri, prøvebetingelser og billeddannelsesmodalitet.

Protokollerne beskrevet her bruger plane eller buede SLB’er, renset protein og en kombination af mikroskopiteknikker. Kvantitativ fluorescens konfokal mikroskopi og total intern refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM) blev brugt til at måle både bulkproteinbinding på forskellige membrankrumninger samt til at måle bindingskinetikken af enkeltmolekyler. Desuden er denne protokol blevet tilpasset til brug med scanningselektronmikroskopi (SEM) til at undersøge protein ultrastruktur på forskellige membrankrumninger. Mens fokus for disse protokoller er på septincytoskelettet, kan protokollerne let ændres for at undersøge krumningsfølsomheden for ethvert protein, som læseren finder interessant. Derudover kan de, der arbejder inden for områder som endocytose eller vesikulær handel, finde disse teknikker nyttige til sondering af krumningsafhængige samlinger af multiproteinkomplekser.

Protocol

BEMÆRK: Dannelse af understøttede lipiddobbeltlag kræver fremstilling af monodisperserede små unilamellare vesikler (SUV’er). Der henvises til en tidligere offentliggjort protokol24 om SUV-dannelse. Kort fortalt dannes alle SUV’er ved sondesonikering i 12 minutter i alt ved 70% amplitude via 4 minutters sonikeringsperioder efterfulgt af 2 minutters hvileperioder i isvand. SUV-løsninger skal være godt afklaret og monodisperseret i størrelse. Størrelsesfordelinger af SUV’er kan måles, for e…

Representative Results

Efter fremstillingen af hver SLB kan septiner eller proteinet af interesse inkuberes med den ønskede støtte og afbildes via TIRFM, konfokal mikroskopi eller SEM. Resultaterne vist her bruger septiner rekombinant udtrykt og renset fra E. coli17. Ved hjælp af TIRFM på plane SLB’er er det muligt at bestemme længden af filamenter og deres fleksibilitet, måle diffusionskoefficienterne og observere samling over tid28,29. For at in…

Discussion

Cellemembraner antager mange forskellige former, krumninger og fysisk-kemiske egenskaber. For at studere det nanometer-skala maskineri, hvorigennem celler bygger mikrometerskalasamlinger, er det nødvendigt at designe minimale rekonstitutionssystemer af membranmimetik. Denne protokol præsenterer teknikker, der præcist styrer både membrankrumning og sammensætning, samtidig med at brugeren let kan foretage kvantitative fluorescensmålinger ved hjælp af bredt tilgængelige mikroskopiteknikker.

<p class="jove_conten…

Materials

0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural	Watson	137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes	USA Scientific	1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips	Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
Egg Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipids	810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade	VWR	16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer	VWR	11652
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-223EA
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191
Magnesium chloride	VWR	7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers	Matsunami	Discontinued	22×22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres	Bangs Laboratories, Inc.	Depends on size: SS0200*-SS0500*	Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive	Norland Thorlabs	NOA 68	Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide	Millipore Sigma	20816-12-0
Parafilm	VWR	52858-000
Plasma Cleaner	Plasma Etch	PE-25	Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride	VWR	0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm	VWR	64-0712
Sonicator bath	Branson	1510R-MT	Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI	Avanti Polar Lipids	840044
Tabletop centrifuge	Eppendorf	22331
UV Lamp	Spectroline	ENF-260C	115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper	VWR	28455-030	42.5 mm diameter, Grade GF/C