बायोफिजिकल गुणों और कार्यों का अध्ययन करने के लिए झिल्ली में सेप्टिन असेंबली का पुनर्गठन
Summary
साइटोस्केलेटन असेंबली को समझने के लिए सेल-मुक्त पुनर्गठन एक महत्वपूर्ण उपकरण रहा है, और पिछले दशक में काम ने न्यूनतम प्रणालियों में सेप्टिन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण स्थापित किए हैं। यहां प्रस्तुत विभिन्न झिल्ली संदर्भों में सेप्टिन असेंबली का निरीक्षण करने के लिए तीन पूरक तरीके हैं: प्लानर बाइलेयर, गोलाकार समर्थन और रॉड समर्थन करता है।
Abstract
अधिकांश कोशिकाएं मौलिक कोशिका प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए अपने आकार को समझ सकती हैं और बदल सकती हैं। कई यूकेरियोट्स में, सेप्टिन साइटोस्केलेटन साइटोकिनेसिस, ध्रुवीकृत विकास और प्रवास जैसे आकार परिवर्तनों के समन्वय में एक अभिन्न घटक है। सेप्टिन फिलामेंट बनाने वाले प्रोटीन हैं जो विविध उच्च-क्रम संरचनाओं को बनाने के लिए इकट्ठा होते हैं और, कई मामलों में, प्लाज्मा झिल्ली के विभिन्न क्षेत्रों में पाए जाते हैं, विशेष रूप से माइक्रोन-स्केल पॉजिटिव वक्रता के क्षेत्रों में। विवो में सेप्टिन असेंबली की प्रक्रिया की निगरानी कोशिकाओं में प्रकाश माइक्रोस्कोपी की सीमाओं के साथ-साथ झिल्ली और साइटोस्केलेटल तत्वों दोनों के साथ बातचीत की जटिलता से बाधित होती है, जिससे जीवित प्रणालियों में सेप्टिन गतिशीलता को निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है। सौभाग्य से, उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्पों पर सेप्टिन असेंबली को नियंत्रित करने वाले तंत्र को विच्छेदित करने के लिए सेल-मुक्त प्रणाली में सेप्टिन साइटोस्केलेटन के पुनर्गठन में पिछले दशक में पर्याप्त प्रगति हुई है। सेप्टिन असेंबली के मुख्य चरणों में सेप्टिन हेटरोलिगोमर एसोसिएशन और झिल्ली के साथ पृथक्करण, फिलामेंट्स में पोलीमराइजेशन और फिलामेंट्स के बीच बातचीत के माध्यम से उच्च-क्रम संरचनाओं का गठन शामिल है। यहां, हम विभिन्न संदर्भों में सेप्टिन असेंबली का निरीक्षण करने के लिए तीन तरीके प्रस्तुत करते हैं: प्लानर बाइलेयर, गोलाकार समर्थन और रॉड समर्थन। इन विधियों का उपयोग असेंबली के विभिन्न चरणों में सेप्टिन के बायोफिजिकल मापदंडों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है: झिल्ली को बांधने वाले एकल ऑक्टेमर्स के रूप में, फिलामेंट्स के रूप में, और फिलामेंट्स की असेंबली के रूप में। हम वक्रता नमूनाकरण और अधिमान्य सोखना के माप के साथ जोड़े गए इन मापदंडों का उपयोग यह समझने के लिए करते हैं कि वक्रता संवेदन विभिन्न लंबाई और समय के तराजू पर कैसे संचालित होता है।
Introduction
कोशिकाओं के आकार और उनके कई आंतरिक डिब्बे लिपिड झिल्ली पर निर्भर हैं जो उन्हें घेरते हैं। झिल्ली विस्कोइलास्टिक संरचनाएं हैं जिन्हें प्रोटीन, लिपिड सॉर्टिंग और विभिन्न प्रकार के आकार 1,2,3,4 उत्पन्न करने के लिए आंतरिक और बाहरी बलों के साथ बातचीत के माध्यम से विकृत किया जा सकता है। इन आकृतियों को अक्सर झिल्ली वक्रता के संदर्भ में वर्णित किया जाता है। कोशिकाएं प्रोटीन के एक विविध सूट का उपयोग करती हैं जो अधिमानतः इकट्ठा करने में सक्षम होती हैं, या “संवेदन”, विशेष झिल्ली वक्रता कोशिका तस्करी, साइटोकिनेसिस और माइग्रेशन 5,6 सहित प्रक्रियाओं पर परिभाषित स्थानिक-अस्थायी नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए। कोशिका स्वास्थ्य के साथ समय और स्थानिक संकल्प को संतुलित करने की कठिनाई के कारण झिल्ली पर सेल मशीनरी की गतिशीलता का निरीक्षण करना विशेष रूप से मुश्किल है। जबकि सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक ऐसी संरचनाओं का विस्तृत दृश्य प्रदान कर सकती है, उन्हें लंबे अधिग्रहण की आवश्यकता होती है जो अधिकांश मशीनरी के लिए असेंबली / इसके अतिरिक्त, उनके मूल वातावरण में इन विधानसभाओं की आणविक जटिलता और भूमिकाओं की भीड़ एक घटक खेल सकते हैं न्यूनतम पुनर्गठन प्रणालियों अणुओं की कार्यात्मक क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाते हैं।
कोशिका के बाहर झिल्ली गुणों और प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए न्यूनतम झिल्ली मिमेटिक्स विकसित किए गए हैं। झिल्ली मिमेटिक्स मुक्त खड़े लिपिड बाइलेयर, जैसे कि लिपोसोम या विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं से समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) 7,8,9,10 तक भिन्न होते हैं। एसएलबी बायोमिमेटिक झिल्ली हैं जो अंतर्निहित समर्थन के लिए लंगर डाले हुए हैं, आमतौर पर ग्लास, अभ्रक या सिलिका11,12 से बने होते हैं। विभिन्न प्रकार की ज्यामिति का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें समतल सतहों, गोले, छड़, और यहां तक कि अवतल और उत्तल वक्रता दोनों पर प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन की जांच करने के लिए लहरदार या माइक्रोपैटर्न सब्सट्रेट भी शामिल हैं1 3,14,15,16,17,18 . बाइलेयर गठन एक हाइड्रोफिलिक सतह पर पुटिका सोखना के साथ शुरू होता है, इसके बाद संलयन और टूटना एक निरंतर बाइलेयर (चित्रा 1) 19 बनाने के लिए होता है। समर्थित बाइलेयर विशेष रूप से प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उत्तरदायी होते हैं, जो कोशिकाओं में अक्सर प्राप्त करने योग्य होने की तुलना में बेहतर समय और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन दोनों प्रदान करते हैं। घुमावदार एसएलबी विशेष रूप से महत्वपूर्ण झिल्ली विरूपण की अनुपस्थिति में प्रोटीन वक्रता संवेदनशीलता की जांच करने के लिए एक आकर्षक साधन प्रदान करते हैं, जिससे वक्रता संवेदन और वक्रता प्रेरण के बीच अंतर करने की अनुमति मिलती है, जो अक्सर मुक्त-खड़े प्रणालियों में अलग करना असंभव होता है।
सेप्टिन फिलामेंट बनाने वाले साइटोस्केलेटल प्रोटीन का एक वर्ग है जो सकारात्मक रूप से घुमावदार झिल्ली 6,18,20 पर इकट्ठा करने की उनकी क्षमता के लिए जाना जाता है। खमीर में सेल चक्र के दौरान, सेप्टिन एक अंगूठी में इकट्ठा होते हैं और क्रमशः कली उद्भव और साइटोकिनेसिस से जुड़े घंटे के चश्मे और डबल रिंग संरचनाओं को बनाने के लिए पुनर्व्यवस्थित करना चाहिए। जबकि प्लैटिनम प्रतिकृति इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अलग-अलग सेल चक्र चरणों22 पर सेप्टिन वास्तुकला का निरीक्षण करने के लिए सुंदर काम किया गया है, खमीर में प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समय के साथ सेप्टिन असेंबली को देखना सीमित स्थानिक संकल्प के साथ मिला है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) द्वारा कल्पना की गई लिपिड मोनोलेयर का उपयोग करके सेप्टिन पर पिछला काम कई दिलचस्प सेप्टिन संरचनाओं जैसे कि छल्ले, बंडल और धुंध23 को पुनर्गठित करने में सक्षम था। हालांकि, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के विपरीत, ईएम तकनीकें अपने अस्थायी संकल्प में भी सीमित हैं। सेप्टिन असेंबली की बहु-पैमाने की प्रक्रिया के गतिज मापदंडों को बेहतर ढंग से हल करने के लिए, हम समर्थित झिल्ली मिमेटिक्स में बदल गए, जहां कोई झिल्ली ज्यामिति, नमूना स्थितियों और इमेजिंग मोडलिटी को सावधानीपूर्वक नियंत्रित कर सकता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्लानर या घुमावदार एसएलबी, शुद्ध प्रोटीन और माइक्रोस्कोपी तकनीकों के संयोजन का उपयोग करते हैं। मात्रात्मक प्रतिदीप्ति कंफोकल माइक्रोस्कोपी और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफएम) का उपयोग विभिन्न झिल्ली वक्रताओं पर थोक प्रोटीन बाध्यकारी दोनों को मापने के साथ-साथ एकल अणुओं के बाध्यकारी कैनेटीक्स को मापने के लिए किया गया था। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न झिल्ली वक्रता पर प्रोटीन अल्ट्रास्ट्रक्चर की जांच करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) के साथ उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया है। जबकि इन प्रोटोकॉल का ध्यान सेप्टिन साइटोस्केलेटन पर है, प्रोटोकॉल को आसानी से किसी भी प्रोटीन की वक्रता संवेदनशीलता की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है जो पाठक को दिलचस्प लगता है। इसके अतिरिक्त, एंडोसाइटोसिस या वेसिकुलर ट्रैफिकिंग जैसे क्षेत्रों में काम करने वालों को इन तकनीकों को बहु-प्रोटीन परिसरों की वक्रता-निर्भर विधानसभाओं की जांच के लिए उपयोगी लग सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कोशिका झिल्ली कई अलग-अलग आकार, वक्रता और भौतिक रासायनिक गुणों को लेती है। नैनोमीटर-स्केल मशीनरी का अध्ययन करने के लिए जिसके माध्यम से कोशिकाएं माइक्रोमीटर-स्केल असेंबली का निर्माण करती हैं, झिल्ली मि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान सं. आर 01 जीएम -130934 और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) अनुदान एमसीबी- 2016022। बीएनसी, ईजेडीवी, और केएससी को पुरस्कार टी 32 जीएम 119999 के तहत नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
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