Rekonstituering av septinmontering vid membran för att studera biofysiska egenskaper och funktioner
Summary
Cellfri rekonstituering har varit ett viktigt verktyg för att förstå cytoskelettsammansättningen, och arbetet under det senaste decenniet har etablerat metoder för att studera septindynamik i minimala system. Här presenteras tre kompletterande metoder för att observera septinmontering i olika membransammanhang: plana dubbelskikt, sfäriska stöd och stavstöd.
Abstract
De flesta celler kan känna av och ändra sin form för att utföra grundläggande cellprocesser. I många eukaryoter är septincytoskelettet en integrerad komponent för att samordna formförändringar som cytokinese, polariserad tillväxt och migration. Septiner är filamentbildande proteiner som samlas för att bilda olika strukturer av högre ordning och i många fall finns i olika delar av plasmamembranet, framför allt i regioner med positiv krökning i mikronskala. Övervakning av processen för septinmontering in vivo hindras av begränsningarna av ljusmikroskopi i celler, liksom komplexiteten i interaktioner med både membran och cytoskelettelement, vilket gör det svårt att kvantifiera septindynamik i levande system. Lyckligtvis har det skett betydande framsteg under det senaste decenniet när det gäller att rekonstituera septincytoskelettet i ett cellfritt system för att dissekera mekanismerna som styr septinmonteringen vid höga rumsliga och tidsmässiga upplösningar. Kärnstegen för septinmontering inkluderar septin heterooligomerassociation och dissociation med membranet, polymerisation i filament och bildandet av högre ordningsstrukturer genom interaktioner mellan filament. Här presenterar vi tre metoder för att observera septinmontering i olika sammanhang: plana dubbelskikt, sfäriska stöd och stavstöd. Dessa metoder kan användas för att bestämma de biofysiska parametrarna för septiner vid olika monteringsstadier: som enkla oktamer som binder membranet, som filament och som sammansättningar av filament. Vi använder dessa parametrar i kombination med mätningar av krökningsprovtagning och preferensadsorption för att förstå hur krökningsavkänning fungerar på olika längd- och tidsskalor.
Introduction
Cellernas former och många av deras inre fack är beroende av lipidmembranen som omger dem. Membran är viskoelastiska strukturer som kan deformeras genom interaktioner med proteiner, lipidsortering och verkande inre och yttre krafter för att generera en mängd olika former 1,2,3,4. Dessa former beskrivs ofta i termer av membrankrökning. Celler använder en mångsidig uppsättning proteiner som företrädesvis kan monteras på, eller “avkänna”, särskilda membrankrökningar för att säkerställa definierad spatio-temporal kontroll över processer inklusive cellhandel, cytokinese och migration 5,6. Dynamiken i cellmaskineriet vid membranet är särskilt svår att observera på grund av svårigheten att balansera tid och rumslig upplösning med cellhälsa. Även om superupplösningstekniker kan erbjuda en detaljerad bild av sådana strukturer, kräver de långa förvärv som inte är mottagliga för tidsskalorna för montering / demontering för de flesta maskiner. Dessutom gör den molekylära komplexiteten hos dessa sammansättningar i deras ursprungliga miljö och de många roller som en enda komponent kan spela minimala rekonstitueringssystem till ett värdefullt verktyg för att studera molekylernas funktionella kapacitet.
Minimal membranmimetik har utvecklats för att studera membranegenskaper och protein-membraninteraktioner utanför cellen. Membranmimetika varierar från fristående lipid-dubbelskikt, såsom liposomer eller gigantiska unilamellarblåsor, till stödda lipid-dubbelskikt (SLBs)7,8,9,10. SLB är biomimetiska membran förankrade i underliggande stöd, vanligtvis bestående av glas, glimmer eller kiseldioxid 11,12. En mängd olika geometrier kan användas, inklusive plana ytor, sfärer, stavar och till och med böljande eller mikromönsterade substrat för att undersöka protein-membraninteraktioner på både konkava och konvexa krökningar samtidigt1 3,14,15,16,17,18 . Dubbelskiktsbildning börjar med vesikeladsorption på en hydrofil yta, följt av fusion och brott för att bilda ett kontinuerligt dubbelskikt (figur 1)19. Stödda dubbelskikt är särskilt mottagliga för ljus- och elektronmikroskopi, vilket ger både bättre tid och rumslig upplösning än vad som ofta kan uppnås i celler. Böjda SDB ger särskilt ett attraktivt sätt att undersöka proteinkrökningskänslighet i frånvaro av signifikant membrandeformation, vilket gör att man kan skilja mellan krökningsavkänning och krökningsinduktion, som ofta är omöjliga att separera i fristående system.
Septiner är en klass av filamentbildande cytoskelettproteiner som är kända för sin förmåga att montera på positivt krökta membran 6,18,20. Under cellcykeln i jäst samlas septiner i en ring och måste omorganiseras för att bilda timglas- och dubbelringstrukturerna associerade med knoppuppkomst respektive cytokinese21. Medan vackert arbete har gjorts med platinareplikelektronmikroskopi för att observera septinarkitektur vid olika cellcykelstadier22, har man sett septinmontering över tid med ljusmikroskopi i jäst mött begränsad rumslig upplösning. Tidigare arbete med septiner med lipidmonolager visualiserade genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) kunde rekonstituera flera intressanta septinstrukturer såsom ringar, buntar och gasbindor23. EM-tekniker är emellertid också begränsade i sin tidsmässiga upplösning, till skillnad från fluorescensmikroskopi. För att bättre lösa de kinetiska parametrarna för den flerskaliga processen för septinmontering vände vi oss till stödd membranmimetik, där man noggrant kan styra membrangeometri, provförhållanden och avbildningsmodalitet.
Protokollen som beskrivs här använder plana eller krökta SLP, renat protein och en kombination av mikroskopitekniker. Kvantitativ fluorescenskonfokal mikroskopi och total intern reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM) användes för att mäta både bulkproteinbindning på olika membrankrökningar, samt för att mäta bindningskinetiken hos enskilda molekyler. Dessutom har detta protokoll anpassats för att användas med svepelektronmikroskopi (SEM) för att undersöka protein ultrastruktur på olika membrankrökningar. Medan fokus för dessa protokoll ligger på septincytoskeletten, kan protokollen enkelt modifieras för att undersöka krökningskänsligheten hos alla proteiner som läsaren tycker är intressanta. Dessutom kan de som arbetar inom områden som endocytos eller vesikulär handel hitta dessa tekniker användbara för att undersöka de krökningsberoende sammansättningarna av multiproteinkomplex.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellmembran får många olika former, krökningar och fysikalisk-kemiska egenskaper. För att studera nanometerskalan genom vilken celler bygger mikrometerskaliga enheter är det nödvändigt att designa minimala rekonstitueringssystem för membranmimetik. Detta protokoll presenterar tekniker som exakt styr både membrankrökning och sammansättning samtidigt som användaren enkelt kan ta kvantitativa fluorescensmätningar med hjälp av allmänt tillgängliga mikroskopitekniker.
De mest kritis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Grant nr. R01 GM-130934 och National Science Foundation (NSF) beviljar MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. och K.S.C. stöddes delvis av ett bidrag från National Institute of General Medical Sciences under tilldelning T32 GM119999.
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
References
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
- Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. 발생학. 401 (1), 92-102 (2015).
- Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
- Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
- Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
- Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
- Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
- Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
- Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
- Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
- Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
- Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Lou, H. -. Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
- Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
- Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
- Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
- Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
- Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
- Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
- Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
- Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
- Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
- Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
- Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
- Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
- Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
