Los métodos inmunohistoquímicos son útiles en la investigación de abejas melíferas para detectar y evaluar el nivel de apoptosis y necrosis en el intestino medio y las glándulas hipofaríngeas de las abejas adultas.
Las abejas melíferas (Apis mellifera L.) dentro de la colmena (obreras nodrizas y otras abejas de la colmena) y fuera de la colmena (recolectoras) están expuestas a cambios climáticos y climáticos, diversos pesticidas, patógenos y desnutrición, que ingresan principalmente por la boca y afectan principalmente el tracto digestivo de las abejas adultas. Para comprender y prevenir los efectos de tales factores estresantes externos e internos en las abejas, un método de investigación útil es el método inmunohistoquímico. Se describe un protocolo básico para preparar el intestino medio (ventrículo) y las glándulas hipofaríngeas (HPG) de las abejas adultas para el análisis histológico. Se describe una metodología detallada para evaluar el nivel de daño celular y distinguir la necrosis de la muerte celular programada (apoptosis) como un proceso natural de regeneración tisular. Se presentan los resultados del tratamiento de abejas adultas con ácido oxálico y pesticidas (insecticida y acaricida) y la determinación de la muerte celular en el ventrículo y HPG. También se discuten los pros y los contras de la metodología.
Las abejas melíferas (Apis mellifera L.) son, entre otros polinizadores silvestres, los polinizadores más importantes de las plantas agrícolas. Durante miles de años, el entorno cambiante ha influido en las abejas para adaptar su morfología, fisiología, comportamiento y tolerancia a varios patógenos y parásitos. Por lo tanto, las abejas han desarrollado una gama muy diversa de especies y subespecies en todo el mundo1. Estos resultados son consistentes con hallazgos previos, que existe variación genética en la estructura del tracto digestivo de la abeja, pero también sugieren que las alteraciones del intestino medio se deben a factores ambientales 2,3.
El tracto digestivo de la abeja melífera tiene tres partes principales: intestino anterior, intestino medio (ventrículo) e intestino posterior4. El ventrículo es un órgano esencial para la digestión del polen y el néctar/miel; En el intestino posterior, el control osmótico tiene lugar a través de la absorción de agua e iones2. Las glándulas hipofaríngeas (HPG) de las obreras de las abejas melíferas se encuentran en la cabeza y sintetizan y secretan componentes de jalea real para alimentar a la cría, la reina y los miembros de la colonia. Su tamaño cambia con la edad y las tareas y depende de una nutrición adecuada (polen de calidad). Las enfermeras trabajadoras de 6 a 18 días realizan la cría de crías, y el tamaño de las HPG aumenta 5,6. En las abejas forrajeras, las HPG degeneran y sólo secretan enzimas que son importantes para convertir los azúcares complejos en simples (α-glucosidasas, leucina arilamidasa, invertasa) en la miel7.
Las abejas están expuestas a varios factores estresantes bióticos y abióticos8, y el tracto digestivo puede verse afectado por varios estimulantes negativos. La primera barrera que protege al organismo de los patógenos es la membrana peritrófica en el intestino medio, que consiste en mucosa intestinal para proteger contra patógenos4. El desarrollo y la función de los HPG dependen de la dieta, la edad y la condición de la colonia9, y se ven afectados por insecticidas, acaricidas 10 y patógenos11,12,13. Los residuos acaricidas en la colmena debido al tratamiento de control de varroa y pesticidas del medio ambiente afectan a las abejas recolectoras y a las abejas nodrizas14,15. La mayor amenaza para las colonias de abejas melíferas es el ácaro Varroa destructor, tanto como vector de virus que contribuyen a la pérdida de colonias16 como consumidor del cuerpo graso del huésped (un órgano vital importante en las abejas), que consecuentemente afecta el cuerpo del individuo y las funciones de la colonia17.
Sin embargo, los hábitats intensivos de tierras de cultivo pueden proporcionar un suministro de alimentos a corto plazo para las abejas. Por lo tanto, los regímenes agroambientales deben mejorar la disponibilidad de flores de miel en los paisajes agrícolas18. Para evaluar la morfología de diferentes subespecies 6,19,20,21 o los efectos subletales de estos factores a nivel celular o tisular, especialmente el intestino medio y las HPG, los métodos histológicos e inmunohistoquímicos son prácticos y suficientemente precisos para ser utilizados en la investigación histológica en abejas.
En los organismos vivos, la muerte celular se define como apoptosis o necrosis25 y puede ir acompañada de autofagia26. La diferencia entre las células apoptóticas y necróticas es que la apoptosis es una forma de muerte celular programada y aparece en células normales, mientras que la necrosis ocurre debido a condiciones letales (por ejemplo, accidente, enfermedad)27,28. La apoptosis se puede detectar utilizando…
The authors have nothing to disclose.
Agradezco el apoyo de la Agencia de Investigación de Eslovenia, subvención nº P4-133.
2-Propanol | |||
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
Covers | |||
DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
Distilled water | |||
Embedding cassette | |||
EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
Flattening table | Leica | HI1220 | |
Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
Formalin 10% | Formaldehyde | ||
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
Hydrogen peroxidase 3% | |||
Incubator | BioRad | ||
Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
KH2PO4 | |||
Lab clock | |||
Light microscope | Leica | ||
Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
Microtome | Leica | ||
Modular tissue embedding station | Leica | ||
Na2HPO4 | |||
NaCl | |||
Paraformaldehyde 4% | |||
Paraplast | Leica | ||
Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
PBS | |||
Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
Proteinase K | Merck | 21627 | |
Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
Water bath | Leica | ||
Watercolor brush | 2x | ||
Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |