Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل اللحمة المتوسطة المعوية للفئران ، بما في ذلك الخلايا الطرفية. يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات ، مثل الزراعة المشتركة مع الفئران أو الكائنات العضوية المشتقة من الإنسان ، لدعم النمو وتعكس بشكل أفضل الوضع في الأنسجة الأصلية.
Abstract
الأمعاء الدقيقة للفأر ، أو اللحمة المتوسطة للقولون ، غير متجانسة للغاية ، وتحتوي على أنواع متميزة من الخلايا بما في ذلك الدم والبطانة اللمفاوية ، والأعصاب ، والخلايا الليفية ، والخلايا الليفية العضلية ، وخلايا العضلات الملساء ، والخلايا المناعية ، ونوع الخلية الذي تم تحديده مؤخرا ، الخلايا التيلوسية. Telocytes هي خلايا اللحمة المتوسطة الفريدة ذات العمليات السيتوبلازمية الطويلة ، حيث تصل إلى مسافة من عشرات إلى مئات الميكرونات من جسم الخلية. ظهرت الخلايا التيلوسيات مؤخرا كمكون مهم للخلايا الجذعية المعوية ، حيث توفر بروتينات Wnt الضرورية لتكاثر الخلايا الجذعية والسلفية.
على الرغم من توفر بروتوكولات حول كيفية عزل اللحمة المتوسطة من أمعاء الفأر ، إلا أنه ليس من الواضح ما إذا كانت هذه الإجراءات تسمح بالعزل الفعال للخلايا الطرفية. يتطلب عزل الخلايا التيلوزيتية بكفاءة تعديلات بروتوكول خاصة تسمح بتفكك الاتصال القوي بين الخلايا الخلوية والخلايا المجاورة دون التأثير على صلاحيتها. هنا ، تم تعديل بروتوكولات عزل اللحمة المتوسطة المعوية المتاحة لدعم العزلة الناجحة وثقافة اللحمة المتوسطة التي تحتوي على غلة عالية نسبيا من الخلايا التيلوسيتية أحادية الخلية القابلة للحياة.
يمكن تحليل تعليق الخلية الواحدة الذي تم الحصول عليه من خلال العديد من التقنيات ، مثل التلوين المناعي ، وفرز الخلايا ، والتصوير ، وتجارب mRNA. ينتج هذا البروتوكول اللحمة المتوسطة مع خصائص مستضدية ووظيفية محفوظة بما فيه الكفاية للخلايا التيلوسية ، ويمكن استخدامها في العديد من التطبيقات. على سبيل المثال ، يمكن استخدامها للاستزراع المشترك مع الكائنات العضوية المشتقة من الفئران أو الإنسان لدعم نمو الأعضاء بدون مكملات عامل النمو ، لتعكس بشكل أفضل الوضع في الأنسجة الأصلية.
Introduction
كل من الأمعاء الدقيقة والقولون هي أنسجة متجددة للغاية بسبب وجود الخلايا الجذعية ، والتي تتكاثر وتجددالوقود 1. يوفر اللحمة المتوسطة المحيطة بالظهارة دعامة تركيبية ووظيفية عن طريق إفراز بروتينات مصفوفة خارج الخلية وجزيئات الإشارة2 ، والتي تعدل استجابة الخلايا الطلائية. Telocytes هي خلايا وسيطة كبيرة ، توصف بشكل أساسي حتى الآن بواسطة المجهر الإلكتروني كخلايا ذات عمليات سيتوبلازمية طويلة تسمى telopodes ، والتي تتداخل لإنشاء شبكة متاهة3،4،5،6،7. في الآونة الأخيرة ، ظهرت الخلايا الطرفية المعوية التي تعبر عن عامل النسخ FOXL1 كمكون مهم للخلايا الجذعية يوفر بروتينات Wnt ، والتي تعتبر ضرورية لوظيفة الخلايا الجذعية والسلفية. تعبر الخلايا التيلوسية المعوية عن مستويات عالية من بروتينات مسار الإشارات الرئيسية مثل Wnt و Bmp و Tgfb و Shh ، بالإضافة إلى العديد من عوامل النمو8.
بالنظر إلى أن الخلايا التيلوسيتية هي مكون متخصص مهم للخلايا الجذعية في الجسم الحي ، فإن تطوير بروتوكولات لعزلها وزراعتها خارج الجسم الحي سيسمح باستخدامها كمصدر لجزيئات الإشارة وعوامل النمو ، لدعم النمو والتمايز خارج الجسم الحي. باستخدام بروتوكولات راسخة ، يمكن عزل خبايا القولون أو الأمعاء الظهارية وتشكيل هياكل ثلاثية الأبعاد تعرف باسم organoids9،10،11. تمثل الكائنات العضوية ثلاثية الأبعاد أداة قوية للتحقيق في كل من فسيولوجيا وأمراض ظهارة الأمعاء خارج الجسم الحي. في نظام خارج الجسم الحي ، تعتمد الكائنات العضوية على المكملات الخارجية لعوامل البقاء والنمو10. يمكن استزراع اللحمة المتوسطة المعزولة مع كل من الفئران والكائنات العضوية المشتقة من الإنسان واستخدامها كمصدر لعوامل النمو ، بدلا من المكملات الخارجية ، لتعكس بشكل أفضل الوضع في الأنسجة الأصلية. دراسة الخلايا التيلوسيتية خارج الجسم الحي لها فوائد عديدة في التحقيق في السلوكيات الخلوية الطبيعية أو المرضية ، وآليات توازن الأنسجة ، والتفاعلات بين الخلايا الخلوية بمزيد من التفصيل.
على الرغم من توفر بروتوكولات تصف كيفية عزل اللحمة المتوسطة من أمعاء الفأر ، إلا أنه ليس من الواضح ما إذا كانت هذه الإجراءات تؤدي إلى عزل فعال للخلايا التيلية. يتطلب العزل الناجح للخلايا telocytes تعديلات بروتوكول خاصة من شأنها أن تسمح بتفكك الاتصال القوي للخلية الخلوية بين الخلايا النهائية والخلايا المجاورة ، دون التأثير على صلاحيتها. للتغلب على هذه القيود ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا معدلا ينتج باستمرار معلقا أحادي الخلية قابل للتطبيق للغاية يحتوي على كمية عالية نسبيا من الخلايا النهائية ذات الخصائص المستضدية والوظيفية المحفوظة بشكل كاف. يمكن استخدام هذه الخلايا الحرارية في العديد من التطبيقات ، بما في ذلك الزراعة المشتركة مع الكائنات العضوية المشتقة من الفئران أو الإنسان ، لدعم النمو بدون مكملات عامل النمو. وهذا بدوره يعكس بشكل أفضل الوضع في الأنسجة الأصلية.
استخدمنا نموذج الماوس FOXL1-Cre: Rosa-mTmG8 ، حيث يتم تمييز الخلايا الطرفية بنسخة مرتبطة بالغشاء من بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) باللون الأخضر ، مما يسمح للمحقق بمتابعة الخلايا التيلوسية بالكامل. جميع خلايا اللحمة المتوسطة الأخرى موسومة بغشاء tdTomato باللون الأحمر. تم تعديل البروتوكول الحالي من بروتوكول عزل اللحمة المتوسطة المعوية12 لتحسين إنتاجية التيلوسيت وقابليتها للحياة.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في الجامعة العبرية في القدس.
1. إعداد الكواشف والمخازن المؤقتة
- سخني حمام مائي إلى 37 درجة مئوية.
- قم بإعداد جميع الحلول في الجدول 1.
2. عزل اللحمة المتوسطة المعوية
- القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق CO2 ، يليه مباشرة خلع عنق الرحم.
- ضع الماوس في وضع ضعيف ورش البطن بنسبة 70٪ EtOH. ارفع جلد البطن واقطعه طوليا على طول خط الوسط لكشف التجويف البريتوني (انظر الشكل 1 I ، II).
- حدد موقع المعدة ، وقطعها من المريء ، واسحب الأمعاء ببطء من التجويف البريتوني. تنظيف الدهون الزائدة والأنسجة الضامة باستخدام ملقط. استئصال الأمعاء الدقيقة من الاثني عشر إلى حوالي 0.5 سم من الأعور (الشكل 1 III ، IV).
- اغسل الأمعاء في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني معقم بارد. باستخدام مقص طرف الكرة ، افتح الأنبوب المعوي طوليا واغسل البراز (الشكل 1 V). نقل الأمعاء إلى طبق جديد يحتوي على برنامج تلفزيوني بارد طازج ويغسل مرة أخرى.
- قطع الأمعاء الدقيقة إلى شرائح طولها 1 سم ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل مملوء ب 8 مل من PBS. هز الأنبوب يدويا في دورة واحدة أو دورتين / ثانية لمدة 1 دقيقة.
- انقل الأجزاء باستخدام الملقط إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء ب 20 مل من المحلول الطازج A (انظر الجدول 1). ضع الأنابيب في حاضنة شاكر مدارية على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، هز الأنبوب بقوة باليد في أربع أو خمس دورات / ثانية لمدة 1 دقيقة لفصل الظهارة.
- كرر الخطوة 2.6 مرة واحدة.
- انقل الأجزاء إلى أنبوب جديد سعة 50 مل مملوء ب 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم ، واقلب الأنبوب في دورة أو دورتين / ثانية لمدة 1 دقيقة.
- انقل الأجزاء إلى أنبوب جديد سعة 15 مل مملوء ب 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم ، وقم بإمالة لأعلى ولأسفل برفق في دورة أو دورتين / ثانية لمدة 2 دقيقة.
- تحت خزانة السلامة البيولوجية ، استخدم ملقط لوضع الأجزاء على مناديل مختبرية معقمة لتجفيفها. بمجرد أن تجف ، قم بقطع الأجزاء إلى قطع 0.5 سم.
- انقل الأجزاء الصغيرة باستخدام الملقط إلى طبق مكون من 6 آبار مملوء ب 4 مل من محلول الهضم المسخن مسبقا لكل بئر. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. هز الطبق برفق باليد كل 20 دقيقة.
- انقل الأجزاء باستخدام ماصة باستور إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 4 مل من DMEM. هز الأنبوب يدويا في أربع أو خمس دورات / ثانية لمدة 1 دقيقة للحصول على تعليق خلية واحدة.
- قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. جهاز الطرد المركزي الترشيح عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من 2٪ FBS / PBS. جهاز طرد مركزي التعليق عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط ، وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 12 مل من وسط الاستزراع ، وزرع 1 مل لكل بئر على لوحين من 6 آبار. في اليوم التالي ، اغسل ونضح أي خلايا ميتة واستبدل الوسط المستهلك بوسط جديد.
ملاحظة: للحفاظ على الأمثل للثقافة ، فمن المستحسن تغيير وسيلة كل 2 أيام. اعتمادا على سلالة الفأر والخلفية الوراثية والعمر ، هناك حاجة إلى 4 أيام إلى 2 أسابيع حتى يكون اللحمة المتوسطة جاهزا لتجارب الاستزراع المشترك. لمزيد من تجارب الاستزراع المشترك ، يجب أن يصل اللحمة المتوسطة إلى نقطة التقاء ، ويعرض مورفولوجيا خلوية مسطحة وممتدة بالكامل كما هو موضح في الشكل 2. بشكل عام ، الخلايا ذات التشكل المستدير ليست قابلة للحياة أو وظيفية.
الشكل 1: تشريح الفأر . (I) ضع الماوس في وضع ضعيف ورش البطن بنسبة 70٪ EtOH. رفع جلد البطن. (II) فتح التجويف البريتوني طوليا على طول خط الوسط. (III) أثناء سحب المعدة برفق ، اقطع المريء. (IV) قرصة المعدة وسحب الأمعاء ببطء. (V) أدخل طرف مقص رأس الكرة في التجويف وافتح الأنبوب المعوي طوليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. إعادة تعليق اللحمة المتوسطة للمرور أو الثقافة المشتركة
- أعد تعليق اللحمة المتوسطة ب 2 مل من 0.25٪ تربسين -0.5 مللي مول EDTA / بئر في لوحة 6 آبار. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، إذا لم تبدأ عدة خلايا بالفعل في الانفصال عن الطبق ، احتضان لمدة 2 دقيقة إضافية.
- باستخدام مكشطة الخلايا ، كشط سطح البئر برفق. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف 2 مل من DMEM-F12 / جيدا وماصة التعليق برفق لأعلى ولأسفل.
ملاحظة: من المهم عدم ملء الأنبوب بأكثر من 50٪ من حجم الأنبوب. لذلك يوصى باستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 8 مل من المعلق لكل بئرين. - عد الخلايا.
ملاحظة: ينتج البئر المتلاقى بالكامل ما بين 2 × 10 6 خلايا و 2.5 × 106 خلايا. - قم بتخفيف معلق الخلية لتحقيق كثافة بذر 3-5 × 105 خلايا / مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط الدقيق.
ملاحظة: من المهم إزالة أكبر قدر ممكن من السوائل. - أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط ولوحة ثقافة مسخنة مسبقا.
4. تحليل التدفق الخلوي لتنقية telocyte
- احصل على حبيبات الخلايا الوسيطة (الخطوة 2.14). أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت FACS وقم بالتصفية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر.
- احتضان معلق الخلية بالأجسام المضادة المترافقة allophycocyanin (APC) CD326 (1: 100) و CD45 (1: 400) و CD31 (1: 250) في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لاستبعاد الخلايا الظهارية والمناعية والبطانية ، على التوالي ، من الصنف.
- اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من محلول FACS وقم بتدويرها لأسفل عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد التعليق في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وأضف 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، 5 مجم / مل ، 1: 1000) لتحليلات قياس التدفق الخلوي. بوابة الخلايا المفردة وفقا لارتفاع SSC بواسطة منطقة SSC. قم ببوابة الخلايا الحية DAPI وأخرج CD45 + / CD31 + / CD326 + لفرز الخلايا النهائية GFP + ، كما هو موضح في الشكل 3.
Representative Results
تم تعديل بروتوكول عزل اللحمة المتوسطة المعوية أعلاه من البروتوكولات الموصوفة في كل من Wu et al.12 و Shoshkes-Carmel et al.8. البروتوكول الموصوف في Wu et al. مخصص للقولون ، والبروتوكول الذي كتبه Shoshkes-Carmel et al. مخصص للأمعاء الدقيقة ، وبالتالي تختلف حالة الهضم في تركيبة الإنزيم وتركيز العمل ووقت الحضانة بين هذين البروتوكولين. هنا ، تم استخدام البروتوكول الموصوف بنجاح لعزل وزراعة خلايا اللحمة المتوسطة المعوية ، بما في ذلك الخلايا الطرفية. باختصار ، قمنا بتشريح الأمعاء الدقيقة من الاثني عشر إلى الدقاق باستخدام FOXL1-Cre: Rosa-mTmG نموذجالماوس 8 ، حيث تم تمييز الخلايا الطرفية بغشاء GFP (أخضر) ، بينما تم تمييز خلايا اللحمة المتوسطة الأخرى بغشاء tdTomato (أحمر). قمنا بفصل الأنسجة باستخدام إنزيمات الهضم وزرعنا اللحمة المتوسطة في طبق من 6 آبار. بعد التفكك ، تفقد الخلايا التيلوسيتية خصائصها الخلوية ، وتظهر مورفولوجيا خلوية مستديرة (الشكل 2 أ) والتي تنعكس في نقص القياس الكمي لخلايا GFP + في اليوم 1 مقارنة بالأيام التالية (الشكل 2F). بعد بضعة أيام ، تظهر الخلايا الطرفية مورفولوجيا خلية صغيرة ممتدة مع عمليات خلوية قصيرة (الشكل 2B ، C). ومع ذلك ، بعد 7-10 أيام من البذر ، تستعيد الخلايا التيلوسيتية خصائصها الخلوية ، وتظهر مورفولوجيا الخلايا الكبيرة الممتدة مع العمليات السيتوبلازمية الطويلة (الشكل 2D ، E) ، وتكون جاهزة للاستخدام في الاستزراع المشترك مع الكائنات العضوية ودعم نموها.
الشكل 2: اللحمة المتوسطة المستزرعة المعزولة من FOXL1Cre: أمعاء الفأر Rosa-mTmG. يتم تمييز الخلايا التيلوسية FOXL1 + ب GFP ، في حين أن خلايا اللحمة المتوسطة الأخرى هي tdTomato +. (أ-ه) صور تمثيلية للحمة المتوسطة المستزرعة المعزولة باستخدام البروتوكول الحالي ، مطلية في لوحة 6 آبار ، وتم تصويرها بعد 1 (A) و 4 (B ، C) و 7 (D ، E) أيام من الثقافة. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. (و) القياس الكمي لنسبة خلايا الطماطم GFP / tdTomato لكل مجال رؤية (النسب المئوية) في الأيام 1 و 4 و 7 من الثقافة. الاختصارات: FOXL1 = بروتين صندوق رأس الشوكة L1 ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لتقييم بروتوكول العزل هذا والكشف عن تكوين الخلية ، قمنا بتحليل تعليق الخلية الذي تم الحصول عليه عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 3). بشكل عام ، كانت 69٪ من الخلايا المعزولة قابلة للحياة بناء على تلطيخ DAPI (الشكل 3 III) ؛ من بين الخلايا الحية ، يمثل 60.9٪ تلوثا ظهاريا وخلايا مناعية وبطانية (CD326 + و CD45 + و CD31 + ؛ CD326 + و CD45 + و CD31 + ؛ CD326 + و CD45 + و CD31 + ؛ CD326 + و CD45 + و CD31 + ؛ CD326 + و CD45 + و CD الشكل 3 IV). جزء telocyte (GFP +) منتشر فوق 100k و 70k FSC و SSC ، على التوالي (الشكل 3 VI) ، ويمثل ما يقرب من 10 ٪ من اللحمة المتوسطة المسورة (CD45- الحية ، CD326- ، CD31-) (الشكل 3 V).
الشكل 3: استراتيجية بوابة قياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا النهائية من اللحمة المتوسطة المعوية للفأر البالغ المعزول. (ط) استبعدت أحداث التشتت الجانبي المنخفض المستوى. (II) تم إغلاق الخلايا المفردة وفقا لارتفاع SSC حسب منطقة SSC. (III) تم إغلاق أحداث DAPI + لاستبعاد الخلايا الميتة من النوع. (IV) تم إغلاق أحداث DAPI- CD45 + / CD326 + / CD31 + لاستبعاد الخلايا المناعية والظهارية والبطانية ، على التوالي. (V) شكلت الخلايا النهائية GFP + 10.3٪ من خلايا DAPI- CD45- / CD326- / CD31-. (VI) كشف تحليل البوابة الخلفية عن إحداثيات الخلايا التيلية GFP + في مخطط FSC-A / SSC-A. الاختصارات: SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ SSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الجانبي ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ APC = الوفيكوسيانين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في موازاة ذلك ، قمنا أيضا بعزل اللحمة المتوسطة من أمعاء الفأر من النوع البري (WT) C57Bl6 ، حيث تم تقييم جزء telocyte باستخدام مجموعة من العلامات السطحية التي تم تحليلها مسبقا على اللحمة المتوسطة المعزولة من نموذج الماوس FOXL1Cre: Rosa-mTmG ، حيث تم تسمية جزء telocyte على GFP. وجدنا أنه يمكن تعريف مجموعة فرعية من الخلايا النهائية من خلال تلطيخ إيجابي ل CD201 و podoplanin (GP38) (الشكل 4). علاوة على ذلك ، أكد استخدام هذه العلامات في التلوين المناعي 1 يوم بعد العزلة والثقافة أنه على الرغم من أن الخلايا لم تظهر بعد خصائصها الخلوية ، إلا أنها حصلت على تعبير عن هذه العلامات الجزيئية ، مما يدل على تلطيخ في 70٪ -80٪ من الخلايا الطرفية GFP + (الشكل 5).
جزء telocyte المحدد بواسطة علامات السطح غير مطابق للجزء الذي تم الحصول عليه باستخدام ماوس المراسلة الذي يحركه FOXL1 ؛ التيلوسيت غير متجانسة للغاية وتحتوي على عدة مجموعات فرعية. من الضروري الجمع بين علامة السطح ووضع العلامات FOXL1 لتعريف telocyte. في الأمعاء الدقيقة لفأر FOXL1Cre: Rosa-mTmG ، 60٪ -70٪ من خلايا GFP + إيجابية CD201 ، و 65٪ -80٪ إيجابية ل GP38. عند استخدام علامات السطح ، من المهم ملاحظة أن التخزين غير المناسب ودورات التجميد والذوبان المتكررة للأجسام المضادة تقلل من كفاءة الربط. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي الهضم الأنزيمي إلى تعطيل تعبير علامة السطح. لاحظنا أن التعبير عن CD138 ، وهو بروتيوغليكان عبر الغشاء يتم التعبير عنه على خلايا اللحمة المتوسطة ، قد تعطل وانخفض بشكل كبير مع التفكك.
الشكل 4: تحليل FACS لمعلق اللحمة المتوسطة أحادي الخلية المعزول من FOXL1Cre: الأمعاء الدقيقة للفأر Rosa-mTmG باستخدام البروتوكول الحالي. تحليل FACS على الخلايا المفردة (I-II) ، (III) DAPI- ، (IV-VI) Lin- (CD45- ، CD326- ، CD31-) GFP + ، مما يدل على أن (VII) 65.3٪ من GFP + و 31.2٪ من الطماطم + إيجابية ل GP38 ، في حين أن (VIII) 60.5٪ من GFP + و 22.6٪ من الطماطم + إيجابية ل CD201. الاختصارات: SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ SSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الجانبي ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ PE = فيكوريثرين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: اليوم الأول من اللحمة المتوسطة المستزرعة، ثابتة وملطخة لعلامات اللحمة المتوسطة. (A-D) صور تمثيلية للحمة المتوسطة المستزرعة الملطخة ل GP38. (واو-ط) صور تمثيلية للحمة المتوسطة المستزرعة الملطخة ل CD201. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. (ه) القياس الكمي للطماطم + GP38 + والطماطم + CD201 + مزدوجة موجبة من إجمالي الطماطم +. (ي) التحديد الكمي ل GFP+ GP38+ و GFP+ CD201+ المزدوج الموجب من مجموع GFP+. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الحل أ: | HBSS مكمل ب 2٪ FBS ، 1 مللي مول DL-ديثيوثريتول (DTT) ، 2 مللي مول EDTA (درجة الحموضة 8.0). | |||
| الوسط المكمل 1640 (CM1640): | RPMI 1640 متوسط مكمل ب 10٪ FBS ، قلم / بكتيريا (100 وحدة بنسلين / مل ، 100 ميكروغرام ستربتومايسين / مل). | |||
| محلول الهضم: | 100 وحدة / مل كولاجيناز من النوع الثامن ، 75 مجم / مل DNase I في 4 مل من CM1640 المسخن مسبقا. ملاحظة: أضف كولاجيناز و DNase I قبل بدء عملية الهضم مباشرة. | |||
| الإعلام الثقافي: | وسط DMEM-F12 مكمل ب 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 10 مللي مول HEPES ، جلوتامين ، قلم / بكتيريا (100 وحدة بنسلين / مل ، 100 ميكروغرام ستربتومايسين / مل). | |||
| المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الاتحادية: | برنامج تلفزيوني مكمل ب 5٪ FBS و 1 mM EDTA. | |||
الجدول 1: تكوين جميع الحلول المستخدمة في البروتوكول.
الجدول التكميلي S1: الاختلافات الرئيسية بين البروتوكول الحالي والبروتوكولين المرجعيين مدرجة هنا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول لعزل اللحمة المتوسطة من الأمعاء الدقيقة للفأر باستخدام نموذج الماوس FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG ، والذي يمكن الباحثين من تمييز الخلايا الطرفية عن خلايا اللحمة المتوسطة الأخرى. هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب اتباعها في هذا البروتوكول. أولا ، من المهم هز الأنبوب بقوة في أربع أو خمس دورات / دورات ، للتخلص من غالبية الخلايا الظهارية أثناء عزل اللحمة المتوسطة. يجب تحسين وقت الحضانة للهضم الأنزيمي بناء على كفاءة الهضم. أثناء الحضانة ، يجب هز الألواح برفق أفقيا لبضع ثوان كل 20 دقيقة. بمجرد أن يصبح النسيج شبيها بالخيوط ، يجب إيقاف الحضانة بالانتقال إلى خطوة البروتوكول 2.12. قد يؤدي تعريض الأنسجة لأوقات الهضم الطويلة إلى انخفاض معدل صلاحية الخلية وإنتاجيتها. بعد الهضم الأنزيمي ، يجب اهتزاز الأنبوب ميكانيكيا لإطلاق المزيد من الخلايا المفردة في التعليق. من الناحية المثالية ، يجب أن يبدو المحلول غائما ، ويجب ألا تكون شظايا الأنسجة مرئية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بإطالة عملية الهضم الأنزيمية إلى 60 دقيقة.
يعد الحفاظ على الظروف المعقمة وتجنب التلوث البكتيري المحتمل إحدى الخطوات الحاسمة عند العمل مع زراعة الأنسجة الأولية. يجب استخدام أدوات تشريح معقمة وكواشف ومخازن مؤقتة ؛ يجب تغيير القفازات ، ويجب تنظيف منطقة العمل عند الانتهاء من العمل مع الحيوانات. بمجرد الحصول على تعليق الخلية ، يجب إجراء العمل تحت غطاء بيولوجي رقائقي. بعد الطلاء ، يجب تحضين الخلايا طوال الليل دون أي اضطرابات ، لأن هذا يمكن أن يؤثر على الالتصاق. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم استبدال وسط الاستزراع بعد يوم واحد من البذر ، لأن الخلايا غير الملتصقة قد تؤثر على جدوى الثقافة.
تفاعلت العلامات السطحية المستخدمة في هذا البروتوكول بقوة مع حواجزها ؛ ومع ذلك ، فمن الممكن أن يؤثر الهضم الأنزيمي على تفاعل الارتباط ، وبالتالي ، نتائج تحليل FACS. قيد آخر لهذا البروتوكول هو التمثيل الناقص للطبقة العضلية. لتحسين كفاءة عزل خلايا طبقة العضلات ، نوصي بالفصل الميكانيكي للعضلة عن طبقات الغشاء المخاطي ، وفصل الهضم الأنزيمي لكل طبقة. لفصل الظهارة عن السدى ، يمكن استخدام عوامل الفصل الميكانيكي أو المخلب (EDTA أو DTT) ؛ ومع ذلك ، تم تحسين الهضم الأنزيمي للحصول على خلايا مفردة في هذا البروتوكول.
تم وصف عزل اللحمة المتوسطة المعوية سابقا8 ؛ قد يؤدي كشط الزغابات باستخدام غطاء إلى فقدان بعض اللحمة المتوسطة إلى جانب الزغابات ، وخاصة خلايا اللحمة المتوسطة ذات الطرف الزغبي مثل الخلايا الطرفية الزغبية Lgr5 + 13. في هذا البروتوكول ، نستخدم كولاجيناز من النوع الثامن بدلا من ديسباز II والتربسين بالاشتراك مع DNase I ، حيث يطلق كولاجيناز خلايا اللحمة المتوسطة من المصفوفة بشكل أكثر كفاءة. على الرغم من أنه يطيل وقت المعالجة (90 دقيقة > مقابل 35 دقيقة) ، فقد أسفر البروتوكولان عن معدلات مماثلة لصلاحية الخلية. أدى البروتوكول الحالي إلى تحسين إنتاجية خلايا اللحمة المتوسطة بشكل عام ، وبشكل أكثر تحديدا من جزء telocyte. أسفر البروتوكول الحالي عن حوالي 10٪ من الخلايا النهائية GFP + ، والتي تم تأكيدها من خلال التصور وتحليل FACS ، بينما أسفر البروتوكول السابق عن 2٪ خلايا GFP + telocytes. وترد الاختلافات الرئيسية بين البروتوكول الحالي والبروتوكولين المرجعيين في الجدول التكميلي S1.
يعتمد تحديد خلايا FOXL1 + GFP + على أنها خلايا تيلوسيتية تحت الظهارة على الدراسات في الجسم الحي. استندت الحاجة إلى تطوير وتعديل بروتوكولات عزل اللحمة المتوسطة المتاحة لإنتاج غلات أعلى من الخلايا التيلوسيتية ، ومعرفة كيفية تحقيق ذلك إلى فهمنا لهيكل ووظيفة الخلايا التيلوسيتية FOXL1 + في الجسم الحي ، كخلايا كبيرة ذات نتوءات خلوية طويلة مرتبطة ارتباطا وثيقا بالخلايا الظهارية.
ومن المثير للاهتمام ، أن الخلايا الطرفية خارج الجسم الحي GFP + تظهر خصائص خلوية مشابهة لخصائصها في الجسم الحي في الأمعاء ، وبالتالي ، يقترح أن تكون بمثابة دعم مثالي لنمو الكائنات العضوية. على الرغم من أن هذا البروتوكول يناقش بشكل أساسي عزل التيلوسيت من الأمعاء الدقيقة ، إلا أنه يمكن استخدام بروتوكول مماثل مع تعديل طفيف وتطبيقه بسهولة على خلايا اللحمة المتوسطة في القولون ، مثل الخلية اللحمية المعوية المنظمة MAP3K2 (MRISC) 12 الموصوفة مؤخرا.
بمجرد أن تمتد خلايا اللحمة المتوسطة وتصل إلى نقطة التقاء ، يمكن استخدامها للعديد من التطبيقات الإضافية ، مثل 3D co-culture مع عضويات مشتقة من الفئران أو الإنسان ، باستخدام Matrigel الخالي من عوامل النمو. يشكل اللحمة المتوسطة عادة شبكة تدعم بشكل كامل تكوين العضوية ونموها بدون مكملات عامل نمو خارجي. تحتوي السدى المعوي على ميزات 3D جوهرية يمكن أن توفر للظهارة الدعم الميكانيكي14. لذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لعزل اللحمة المتوسطة ليتم دمجها في سقالة مطبوعة بيولوجيا 3D واستخدامها لمزيد من تجارب xenograft.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة شخصية MSC) والبرنامج المشترك بين مؤسسة العلوم الإسرائيلية والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
| APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
| APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
| APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
| DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
| DNase I | Sigma | DN25-1G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
| FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
| Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
| Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |
References
- Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., Näthke, I. Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).
- Kinchen, J., et al. Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease. Cell. 175 (2), 372-386 (2018).
- Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -S. TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).
- Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. Telocytes in endocardium: electron microscope evidence. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).
- Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. Telocytes in human skin—are they involved in skin regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).
- Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy. Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).
- Popescu, L. M., et al.
- Shoshkes-Carmel, M., et al. Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts. Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
- Bahar Halpern, K., et al. Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip. Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).
- Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G.
