Summary
Hier presenteren we een protocol om muizendarmmesenchym te isoleren, inclusief telocyten. Deze kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, zoals co-cultuur met muis of van de mens afgeleide organoïden, om de groei te ondersteunen en de situatie in het oorspronkelijke weefsel beter weer te geven.
Abstract
De murine dunne darm, of colon mesenchym, is zeer heterogeen en bevat verschillende celtypen, waaronder bloed en lymfatisch endotheel, zenuwen, fibroblasten, myofibroblasten, gladde spiercellen, immuuncellen en het onlangs geïdentificeerde celtype, telocyten. Telocyten zijn unieke mesenchymale cellen met lange cytoplasmatische processen, die een afstand van tientallen tot honderden microns van het cellichaam bereiken. Telocyten zijn onlangs naar voren gekomen als een belangrijke intestinale stamcelnichecomponent, die Wnt-eiwitten levert die essentieel zijn voor de proliferatie van stam- en voorlopercellen.
Hoewel er protocollen beschikbaar zijn voor het isoleren van mesenchym uit de darm van de muis, is het niet duidelijk of deze procedures de efficiënte isolatie van telocyten mogelijk maken. Het efficiënt isoleren van telocyten vereist speciale protocolaanpassingen die dissociatie van het sterke cel-celcontact tussen telocyten en naburige cellen mogelijk maken zonder hun levensvatbaarheid te beïnvloeden. Hier werden beschikbare intestinale mesenchymisolatieprotocollen aangepast om de succesvolle isolatie en kweek van mesenchym met een relatief hoge opbrengst van levensvatbare eencellige telocyten te ondersteunen.
De verkregen eencellige suspensie kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende technieken, zoals immunostaining, celsortering, beeldvorming en mRNA-experimenten. Dit protocol levert mesenchym op met voldoende geconserveerde antigene en functionele eigenschappen van telocyten en kan voor verschillende toepassingen worden gebruikt. Ze kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor co-cultuur met muis- of van de mens afgeleide organoïden om organoïde groei te ondersteunen zonder groeifactorsuppletie, om de situatie in het oorspronkelijke weefsel beter weer te geven.
Introduction
Zowel de dunne darm als de dikke darm zijn zeer regeneratieve weefsels vanwege de aanwezigheid van stamcellen, die zich vermenigvuldigen en regeneratie van brandstof voeden1. Het mesenchym rond het epitheel biedt structurele en functionele ondersteuning door extracellulaire matrixeiwitten en signaalmoleculen2 af te scheiden, die de respons van epitheelcellen moduleren. Telocyten zijn grote mesenchymale cellen, tot nu toe voornamelijk beschreven door elektronenmicroscopie als cellen met lange cytoplasmatische processen genaamd telopodes, die overlappen om een labyrintisch netwerk te creëren 3,4,5,6,7. Onlangs zijn intestinale telocyten die de transcriptiefactor FOXL1 tot expressie brengen, naar voren gekomen als een belangrijke stamcelnichecomponent die Wnt-eiwitten levert, die cruciaal zijn voor de stam- en voorlopercelfunctie. Intestinale telocyten drukken hoge niveaus van belangrijke signaalwegeiwitten uit, zoals Wnt, Bmp, Tgfb en Shh, evenals vele groeifactoren8.
Aangezien telocyten in vivo een kritische stamcelnichecomponent zijn, zal het ontwikkelen van protocollen om ze ex vivo te isoleren en te kweken, het gebruik ervan als bron voor signaalmoleculen en groeifactoren mogelijk maken, om groei en differentiatie ex vivo te ondersteunen. Met behulp van gevestigde protocollen kunnen colon- of darmepitheelcrypten worden geïsoleerd en 3D-structuren vormen die bekend staan als organoïden 9,10,11. Driedimensionale organoïden vormen een krachtig hulpmiddel om zowel de fysiologie als de pathologie van het darmepitheel ex vivo te onderzoeken. In een ex vivo systeem vertrouwen organoïden op exogene suppletie van factoren voor overleving en groei10. Geïsoleerd mesenchym kan worden gekweekt met zowel muis als van de mens afgeleide organoïden en worden gebruikt als een bron van groeifactoren, in plaats van exogene suppletie, om de situatie in het oorspronkelijke weefsel beter weer te geven. Het bestuderen van telocyten ex vivo heeft tal van voordelen bij het onderzoeken van normaal of pathologisch cellulair gedrag, mechanismen van weefselhomeostase en cel-celinteracties in meer detail.
Hoewel er protocollen beschikbaar zijn die beschrijven hoe mesenchym uit de darm van de muis kan worden geïsoleerd, is het niet duidelijk of deze procedures resulteren in de efficiënte isolatie van telocyten. Succesvolle isolatie van telocyten vereist speciale protocolaanpassingen die dissociatie van het sterke cel-celcontact tussen de telocyten en naburige cellen mogelijk maken, zonder hun levensvatbaarheid te beïnvloeden. Om deze beperkingen te overwinnen, presenteert dit artikel een aangepast protocol dat consequent een zeer levensvatbare, eencellige suspensie oplevert met een relatief grote hoeveelheid telocyten met voldoende geconserveerde antigene en functionele eigenschappen. Deze telocyten kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder co-cultuur met muis- of menselijke organoïden, om de groei te ondersteunen zonder suppletie met groeifactoren. Dit weerspiegelt op zijn beurt beter de situatie in het oorspronkelijke weefsel.
We gebruikten de FOXL1-Cre: Rosa-mTmG muismodel8, waarin telocyten worden gelabeld met een membraangebonden versie van groen fluorescerend eiwit (GFP) in groen, waardoor de onderzoeker telocyten in hun geheel kan volgen; alle andere mesenchymale cellen zijn gelabeld met een membraangebonden tdTomato in rood. Het huidige protocol werd gewijzigd van een protocol dat intestinale mesenchym12 isoleert om de opbrengst en levensvatbaarheid van telocyten te verbeteren.
Protocol
Alle hieronder beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem.
1. Bereiding van reagentia en buffers
- Verwarm een waterbad voor op 37 °C.
- Bereid alle oplossingen in tabel 1 voor.
2. Intestinale mesenchym isolatie
- Euthanaseer de muis door CO 2-inhalatie, onmiddellijk gevolgd door cervicale dislocatie.
- Plaats de muis in rugligging en spuit de buik in met 70% EtOH. Til de buikhuid op en snijd in de lengterichting langs de middellijn om de peritoneale holte bloot te leggen (zie figuur 1 I,II).
- Lokaliseer de maag, snijd uit de slokdarm en trek langzaam de darm uit de peritoneale holte. Reinig overtollig vet en bindweefsel met een tang. Snijd de dunne darm uit de twaalfvingerige darm tot ongeveer 0,5 cm van de blindedarm (figuur 1 III,IV).
- Was de darm in een petrischaaltje met koude steriele PBS. Open met een kogelpuntschaar de darmbuis in de lengterichting en spoel de ontlasting uit (figuur 1 V). Breng de darm over in een nieuwe schaal met verse koude PBS en was opnieuw.
- Snijd de dunne darm in segmenten van 1 cm lang en breng over in een conische buis van 15 ml gevuld met 8 ml PBS. Schud de buis handmatig met één of twee cycli (s) gedurende 1 minuut.
- Breng de segmenten met een tang over in een conische buis van 50 ml gevuld met 20 ml vers gemaakte oplossing A (zie tabel 1). Plaats de buizen gedurende 20 minuten in een orbitale shakerincubator bij 37 °C. Schud de buis na incubatie krachtig met de hand bij vier of vijf cycli /s gedurende 1 minuut om het epitheel te dissociëren.
- Herhaal stap 2.6 eenmaal.
- Breng de segmenten over in een nieuwe buis van 50 ml gevuld met 10 ml steriele PBS en keer de buis om met één of twee cycli (s) gedurende 1 minuut.
- Breng de segmenten over in een nieuwe buis van 15 ml gevuld met 10 ml steriele PBS en kantel zachtjes op en neer met één of twee cycli /s gedurende 2 minuten.
- Gebruik onder een bioveiligheidskast een tang om de segmenten op een steriel laboratoriumdoekje te plaatsen om ze uit te drogen. Snijd de partjes eenmaal gedroogd verder in stukjes van 0,5 cm.
- Breng de kleine segmenten met een tang over in een 6-wells plaat gevuld met 4 ml voorverwarmde digestie-oplossing per put. Incubeer bij 37 °C gedurende 50 min. Schud het bord voorzichtig met de hand om de 20 min.
- Breng de segmenten over met behulp van een Pasteur-pipet in een conische buis van 15 ml gevuld met 4 ml DMEM. Schud de buis handmatig bij vier of vijf cycli (s) gedurende 1 minuut om een eencellige suspensie te krijgen.
- Filter de suspensie door een zeef van 100 μm in een conische buis van 50 ml. Centrifugeer het filtraat gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 700 × g .
- Gooi het supernatant weg door aspiratie en resuspensie van de celkorrel in 5 ml 2% FBS / PBS. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 700 × g bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg door aspiratie, resuspensie van de celkorrel met 12 ml kweekmedium en zaai 1 ml per put op twee 6-putplaten. Was en zuig de volgende dag eventuele stervende cellen op en vervang het gebruikte medium door vers medium.
OPMERKING: Voor een optimaal onderhoud van de cultuur wordt aanbevolen om het medium om de 2 dagen te vervangen. Afhankelijk van de muizenstam, genetische achtergrond en leeftijd zijn 4 dagen tot 2 weken nodig om het mesenchym klaar te maken voor co-cultuurexperimenten. Voor verdere co-cultuurexperimenten zou mesenchym confluentie moeten bereiken, met platte en volledig uitgerekte cellulaire morfologie zoals weergegeven in figuur 2. Over het algemeen zijn cellen met ronde morfologie niet levensvatbaar of functioneel.
Figuur 1: Muisdissectie . (I) Plaats de muis in rugligging en besproei de buik met 70% EtOH. Til de buikhuid op. (II) Open de peritoneale holte in de lengterichting langs de middellijn. (III) Terwijl u zachtjes aan de maag trekt, snijdt u de slokdarm door. (IV) Knijp in de maag en trek langzaam de darm eruit. (V) Steek de punt van de kogelpuntschaar in het lumen en open de darmbuis in de lengterichting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Mesenchym resuspensie voor passaging of co-cultuur
- Resuspendeer het mesenchym met 2 ml 0,25% trypsine-0,5 mM EDTA/put in een 6-well plaat. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Na incubatie, als verschillende cellen nog niet zijn begonnen los te komen van de schaal, incubeer dan nog eens 2 minuten.
- Schraap met behulp van een celschraper voorzichtig het oppervlak van de put. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml. Voeg 2 ml DMEM-F12/put toe en pipetteer de suspensie voorzichtig op en neer.
OPMERKING: Het is belangrijk om de buis niet te veel te vullen met meer dan 50% van het buisvolume. Het wordt daarom aanbevolen om voor elke twee putten een conische buis van 15 ml gevuld met 8 ml suspensie te gebruiken. - Tel de cellen.
OPMERKING: Een volledig confluente put levert tussen 2 × 10 6 cellen en 2,5 × 106 cellen op. - Verdun de celsuspensie om een zaaidichtheid van 3-5 × 105 cellen/ml te bereiken. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C en gooi het supernatant weg door voorzichtige aspiratie.
OPMERKING: Het is belangrijk om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen. - Resuspendie van de celkorrel in voorverwarmd kweekmedium en plaat.
4. Flowcytometrie-analyse voor telocytenzuivering
- Verkrijg de mesenchymale celkorrel (stap 2.14). Resuspendie van de celkorrel in 1 ml FACS-buffer en filtreer door een zeef van 40 μm.
- Incubeer de celsuspensie met allophycocyanine (APC)-geconjugeerde CD326 (1:100), CD45 (1:400) en CD31 (1:250) antilichamen in 400 μL FACS-buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om respectievelijk epitheel-, immune- en endotheelcellen uit te sluiten van de soort.
- Was de cellen door 1 ml FACS-buffer toe te voegen en draai gedurende 5 minuten bij 4 °C af op 700 × g. Resuspendeer in 400 μL FACS-buffer en voeg 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 5 mg/ml, 1:1.000) toe voor flowcytometrie-analyses. Ompoort de afzonderlijke cellen volgens de SSC-hoogte per SSC-gebied. Gate de DAPI- live cellen en gate out CD45+/CD31+/CD326+ om de GFP+ telocyten te sorteren, zoals weergegeven in Figuur 3.
Representative Results
Het bovenstaande intestinale mesenchymisolatieprotocol werd gewijzigd op basis van protocollen beschreven in zowel Wu et al.12 als Shoshkes-Carmel et al.8. Het protocol beschreven in Wu et al. is voor de dikke darm, en dat van Shoshkes-Carmel et al. is voor de dunne darm, dus de spijsverteringsconditie is verschillend in enzymcombinatie, werkconcentratie en incubatietijd tussen deze twee protocollen. Hier is het beschreven protocol met succes gebruikt om intestinale mesenchymale cellen, waaronder telocyten, te isoleren en te kweken. In het kort ontleedden we de dunne darm van de twaalfvingerige darm naar het ileum met behulp van een FOXL1-Cre: Rosa-mTmG-muis model8, waarin de telocyten werden gelabeld met membraan-GFP (groen), terwijl andere mesenchymale cellen werden gelabeld met membraan-tdTomato (rood). We dissocieerden het weefsel met behulp van verterende enzymen en zaaiden het mesenchym in een 6-well plaat. Na dissociatie verliezen telocyten hun cellulaire kenmerken, wat een ronde cellulaire morfologie laat zien (figuur 2A), wat wordt weerspiegeld in de onderkwantificering van GFP+ cellen op dag 1 in vergelijking met de volgende dagen (figuur 2F). Na enkele dagen vertonen telocyten een kleine uitgerekte celmorfologie met korte cellulaire processen (figuur 2B,C). Echter, 7-10 dagen na het zaaien, krijgen telocyten hun cellulaire kenmerken terug, vertonen grote uitgerekte celmorfologie met lange cytoplasmatische processen (figuur 2D, E), en zijn klaar om te worden gebruikt in co-cultuur met organoïden en ondersteunen hun groei.
Figuur 2: Gekweekt mesenchym geïsoleerd uit FOXL1Cre: Rosa-mTmG muizendarm. FOXL1+ telocyten zijn gelabeld met GFP, terwijl andere mesenchymale cellen tdTomato+ zijn. (A-E) Representatieve afbeeldingen van gekweekt mesenchym geïsoleerd met behulp van het huidige protocol, verguld in een 6-well plaat, en afgebeeld na 1 (A), 4 (B, C) en 7 (D, E) dagen van cultuur. Schaalbalken = 100 μm. (F) Kwantificering van de GFP/tdTomato-celverhouding per gezichtsveld (percentages) op dag 1, 4 en 7 van de cultuur. Afkortingen: FOXL1 = Forkhead box L1 protein; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om dit isolatieprotocol te evalueren en de celsamenstelling te onthullen, analyseerden we de verkregen celsuspensie door flowcytometrie (figuur 3). Over het algemeen was 69% van de geïsoleerde cellen levensvatbaar op basis van DAPI-kleuring (figuur 3 III); van de levende cellen vertegenwoordigde 60,9% epitheliale besmetting en immuun- en endotheelcellen (CD326+, CD45+ en CD31+; Figuur 3 IV). De telocytenfractie (GFP+) verspreidde zich boven respectievelijk 100k en 70k FSC en SSC (figuur 3 VI), en vertegenwoordigde bijna 10% van het gated mesenchym (live CD45-, CD326-, CD31-) (figuur 3 V).
Figuur 3: Flowcytometrie gating strategie voor het sorteren van telocyten uit geïsoleerd volwassen muizendarmmesenchym. (I) Low-level side scatter events werden uitgesloten. (II) Enkele cellen werden afgesloten volgens SSC-hoogte per SSC-gebied. (III) DAPI+ events werden afgesloten om dode cellen uit te sluiten van de sortering. (IV) DAPI-CD45+/CD326+/CD31+ gebeurtenissen werden afgesloten om respectievelijk immuun-, epitheel- en endotheelcellen uit te sluiten. (V) GFP+ telocyten waren goed voor 10,3% van de DAPI-CD45-/CD326-/CD31-cellen. (VI) Back-gating analyse onthulde de coördinaten van GFP+ telocyten in een FSC-A/SSC-A plot. Afkortingen: SSC-A = side scatter-peak area; FSC-A = voorwaarts verstrooid-piekgebied; SSC-H = zijverstrooiing-piekhoogte; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; GFP = groen fluorescerend eiwit; APC = allophycocyanine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tegelijkertijd isoleerden we ook mesenchym uit een wild-type (WT) C57Bl6 muizendarm, waarin de telocytfractie werd geëvalueerd met behulp van een combinatie van oppervlaktemarkers die eerder waren geanalyseerd op mesenchym geïsoleerd uit een FOXL1Cre: Rosa-mTmG-muismodel, waarin de telocytfractie GFP-gelabeld was. We vonden dat een subset van de telocyten kan worden gedefinieerd door een positieve kleuring naar CD201 en podoplanine (GP38) (figuur 4). Bovendien bevestigde het gebruik van deze markers in immunostaining 1 dag na isolatie en kweek dat, hoewel de cellen hun cellulaire kenmerken nog niet vertoonden, ze de expressie van deze moleculaire markers verkregen, met kleuring in 70% -80% van de GFP + telocyten (figuur 5).
De telocytfractie gedefinieerd door oppervlaktemarkers is niet identiek aan die verkregen met behulp van de FOXL1-aangedreven reportermuis; De telocyt is zeer heterogeen en bevat verschillende deelverzamelingen. Het is noodzakelijk om de oppervlaktemarker te combineren met FOXL1-etikettering voor telocytendefinitie. In de dunne darm van deFOXL1Cre: Rosa-mTmG muis, 60%-70% van de GFP+ cellen zijn CD201 positief, en 65%-80% zijn positief voor GP38. Bij het gebruik van oppervlaktemarkers is het belangrijk op te merken dat onjuiste opslag en repetitieve vries-ontdooicycli van antilichamen de bindingsefficiëntie verminderen. Bovendien kan enzymatische vertering de expressie van oppervlaktemarkers verstoren. We zagen dat de expressie van CD138, een transmembraan proteoglycaan dat tot expressie komt op mesenchymale cellen, verstoord was en sterk afnam met dissociatie.
Figuur 4: FACS-analyse van eencellige mesenchymsuspensie geïsoleerd uit FOXL1Cre: Rosa-mTmG muis dunne darm met behulp van het huidige protocol. FACS-analyse op (I-II) enkelvoudige cellen, (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+-cellen, waaruit blijkt dat (VII) 65,3% van de GFP+ en 31,2% van de Tomato+ positief zijn voor GP38, terwijl (VIII) 60,5% van de GFP+ en 22,6% van de Tomato+ positief zijn voor CD201. Afkortingen: SSC-A = side scatter-peak area; FSC-A = voorwaarts verstrooid-piekgebied; SSC-H = zijverstrooiing-piekhoogte; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; GFP = groen fluorescerend eiwit; APC = allophycocyanine; PE = fycoerythrin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Dag één gekweekt mesenchym, gefixeerd en gekleurd voor mesenchymale markers. (A-D) Representatieve beelden van gekweekt mesenchym gekleurd voor GP38. (F-I) Representatieve afbeeldingen van gekweekt mesenchym gekleurd voor CD201. Schaalstaven = 100 μm. (E) Kwantificering van Tomaat+ GP38+ en Tomaat+ CD201+ dubbelpositief van totaal Tomaat+. (J) Kwantificering van GFP+ GP38+ en GFP+ CD201+ dubbelpositief van de totale GFP+. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing A: | HBSS aangevuld met 2% FBS, 1 mM DL-dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA (pH 8,0). | |||
| Aangevuld medium 1640 (CM1640): | RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS, Pen/Strep (100 eenheden penicilline/ml, 100 μg streptomycine/ml). | |||
| Digestie-oplossing: | 100 U/ml collagenase type VIII, 75 mg/ml DNase I in 4 ml voorverwarmd CM1640. Opmerking: Voeg collagenase en DNase I toe vlak voordat de verteringsprocedure begint. | |||
| Cultuur media: | DMEM-F12 media aangevuld met 10 μg/ml gentamicine, 10 mM HEPES, glutamine, Pen/Strep (100 eenheden penicilline/ml, 100 μg streptomycine/ml). | |||
| FACS-buffer: | PBS aangevuld met 5% FBS en 1 mM EDTA. | |||
Tabel 1: Samenstelling van alle in het protocol gebruikte oplossingen.
Aanvullende tabel S1: De belangrijkste verschillen tussen het huidige protocol en de twee referentieprotocollen worden hier opgesomd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Hier ontwikkelden we een protocol om mesenchym te isoleren uit de dunne darm van muizen met behulp van het FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG-muismodel, waarmee onderzoekers telocyten kunnen onderscheiden van andere mesenchymale cellen. Er zijn enkele kritieke stappen die u in dit protocol moet volgen. Ten eerste is het belangrijk om de buis krachtig te schudden bij vier of vijf cycli / s, om de meerderheid van de epitheelcellen weg te gooien tijdens mesenchymisolatie. De incubatietijd voor enzymatische vertering moet worden geoptimaliseerd op basis van de efficiëntie van de spijsvertering. Tijdens de incubatie moeten de platen elke 20 minuten gedurende enkele seconden voorzichtig horizontaal worden geschud. Zodra het weefsel filamentachtig wordt, moet de incubatie worden gestopt door door te gaan met protocolstap 2.12. Het blootstellen van het weefsel voor lange verteringstijden kan resulteren in een lage levensvatbaarheid en opbrengst van de cel. Na enzymatische vertering moet de buis mechanisch worden geschud om meer afzonderlijke cellen in suspensie vrij te geven; Idealiter ziet de oplossing er troebel uit en zijn er geen weefselfragmenten zichtbaar. Als dit niet het geval is, verleng dan de enzymatische spijsvertering tot 60 min.
Het houden van steriele omstandigheden en het vermijden van mogelijke bacteriële besmetting is een van de kritieke stappen bij het werken met primaire weefselkweek. Er moeten steriele ontleedmiddelen, reagentia en buffers worden gebruikt; Handschoenen moeten worden vervangen en het werkgebied moet worden schoongemaakt wanneer er met dieren wordt gewerkt. Zodra de celsuspensie is verkregen, moet het werk worden uitgevoerd onder een laminaire biologische kap. Na plating moeten cellen 's nachts worden geïncubeerd zonder verstoringen, omdat dit de hechting kan beïnvloeden. Bovendien is het belangrijk om het kweekmedium een dag na het zaaien te vervangen, omdat niet-hechtende cellen de levensvatbaarheid van de cultuur kunnen beïnvloeden.
Oppervlaktemarkers die in dit protocol werden gebruikt, reageerden sterk met hun epitopen; het is echter mogelijk dat enzymatische spijsvertering de bindingsreactiviteit beïnvloedt, en daarom resultaten van FACS-analyse. Een andere beperking van dit protocol is de ondervertegenwoordiging van de muscularislaag. Om de efficiëntie van spierlaagcelisolatie te verbeteren, raden we mechanische scheiding van de spier van de slijmvlieslagen aan en afzonderlijke enzymatische spijsvertering voor elk van de lagen. Voor het scheiden van het epitheel van het stroma kunnen mechanische scheiding of chelaatvormers (EDTA of DTT) worden gebruikt; Enzymatische vertering voor het verkrijgen van afzonderlijke cellen is echter geoptimaliseerd in dit protocol.
Isolatie van intestinale mesenchym is eerder beschreven8; Het afschrapen van de villi met een coverslip zou het verlies van wat mesenchym naast de villus veroorzaken, vooral villustip mesenchymale cellen zoals Lgr5+ villus tip telocyten13. In dit protocol gebruiken we collagenase type VIII in plaats van dispase II en trypsine in combinatie met DNase I, omdat collagenase efficiënter mesenchymale cellen uit de matrix vrijgeeft. Hoewel het de verwerkingstijd verlengt (>90 min versus 35 min), leverden de twee protocollen vergelijkbare levensvatbaarheidspercentages van cellen op; Het huidige protocol verbeterde de opbrengst van de mesenchymale cellen in het algemeen, en meer specifiek van de telocytenfractie. Het huidige protocol leverde ongeveer 10% GFP+ telocyten op, bevestigd door zowel visualisatie als door FACS-analyse, terwijl het eerdere protocol 2% GFP+ telocyten opleverde. De belangrijkste verschillen tussen het huidige protocol en de twee referentieprotocollen zijn opgenomen in aanvullende tabel S1.
De identificatie van FOXL1+GFP+ cellen als subepitheliale telocyten is gebaseerd op in vivo studies. De noodzaak om beschikbare mesenchymisolatieprotocollen te ontwikkelen en te wijzigen om hogere opbrengsten van telocyten te produceren, en de kennis van hoe dit te bereiken, was gebaseerd op ons begrip van de structuur en functie van FOXL1 + telocyten in vivo, als grote cellen met lange cellulaire projecties die nauw verbonden zijn met epitheelcellen.
Interessant is dat ex vivo GFP + telocyten cellulaire kenmerken vertonen die vergelijkbaar zijn met hun kenmerken in vivo in de darm en daarom worden voorgesteld om te dienen als een ideale ondersteuning voor organoïde groei. Hoewel dit protocol voornamelijk telocytenisolatie uit de dunne darm bespreekt, kan een soortgelijk protocol met kleine modificatie worden gebruikt en gemakkelijk worden toegepast voor mesenchymale coloncellen, zoals de onlangs beschreven MAP3K2-gereguleerde intestinale stromale cel (MRISC)12.
Zodra de mesenchymale cellen zijn uitgerekt en confluentie hebben bereikt, kunnen ze worden gebruikt voor verschillende extra toepassingen, zoals 3D-co-cultuur met muis- of van de mens afgeleide organoïden, met behulp van groeifactorvrije Matrigel. Het mesenchym vormt meestal een netwerk dat organoïdevorming en -groei volledig ondersteunt zonder exogene groeifactorsuppletie. Het darmstroma heeft intrinsieke 3D-kenmerken die het epitheel mechanische ondersteuning kunnen bieden14. Daarom kan dit protocol ook worden gebruikt om mesenchym te isoleren om te worden geïntegreerd in een 3D-bio-geprinte steiger en te worden gebruikt voor verdere xenograftexperimenten.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (MSC persoonlijke beurs) en het gezamenlijke programma tussen de Israel Science Foundation en de National Natural Science Foundation of China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
| APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
| APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
| APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
| DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
| DNase I | Sigma | DN25-1G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
| FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
| Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
| Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |
References
- Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., Näthke, I. Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).
- Kinchen, J., et al. Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease. Cell. 175 (2), 372-386 (2018).
- Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -S. TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).
- Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. Telocytes in endocardium: electron microscope evidence. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).
- Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. Telocytes in human skin—are they involved in skin regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).
- Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy. Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).
- Popescu, L. M., et al.
- Shoshkes-Carmel, M., et al. Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts. Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
- Bahar Halpern, K., et al. Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip. Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).
- Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G.
