Summary
Die D-Loop Capture (DLC) und D-Loop Extension (DLE) Assays nutzen das Prinzip der Proximity-Ligation zusammen mit quantitativer PCR, um D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und Produktbildung am Ort eines induzierbaren doppelsträngigen Bruchs in Saccharomyces cerevisiae zu quantifizieren.
Abstract
DNA-Schäden, einschließlich DNA-Doppelstrangbrüche und Interstrang-Vernetzungen, die während der S- und G2-Phasen des Zellzyklus entstehen, können durch homologe Rekombination (HR) repariert werden. Darüber hinaus stellt HR einen wichtigen Mechanismus der Replikationsgabelrettung nach Strömungsabriss oder Zusammenbruch dar. Die Regulierung der vielen reversiblen und irreversiblen Schritte dieses komplexen Weges fördert seine Treue. Die physikalische Analyse der während der HR gebildeten Rekombinationszwischenprodukte ermöglicht die Charakterisierung dieser Kontrollen durch verschiedene Nukleoproteinfaktoren und deren Interaktoren. Obwohl es gut etablierte Methoden gibt, um spezifische Ereignisse und Zwischenprodukte im Rekombinationsweg zu untersuchen, hat sich der Nachweis der Bildung und Ausdehnung der D-Schleife, zwei kritische Schritte in diesem Signalweg, bis vor kurzem als schwierig erwiesen. Hier werden effiziente Methoden zum Nachweis von Schlüsselereignissen im HR-Signalweg beschrieben, nämlich DNA-Doppelstrang-Bruchbildung, D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und die Bildung von Produkten durch bruchinduzierte Replikation (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Diese Assays detektieren ihre relevanten Rekombinationszwischenprodukte und Produkte mit hoher Empfindlichkeit und sind unabhängig von der zellulären Lebensfähigkeit. Die Erkennung von D-Schleifen, D-Schleifenverlängerung und dem BIR-Produkt basiert auf der Proximity-Ligatur. Zusammen ermöglichen diese Assays die Untersuchung der Kinetik von HR auf Populationsebene, um die Funktionen von HR-Proteinen und Regulatoren in signifikanten Schritten des Signalwegs genau zu adressieren.
Introduction
Homologe Rekombination (HR) ist ein High-Fidelity-Mechanismus zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Interstrang-Vernetzungen und ssDNA-Lücken sowie ein Weg für die DNA-Schadenstoleranz. HR unterscheidet sich von fehleranfälligen Wegen für die Reparatur / Toleranz von DNA-Schäden, wie nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und Transläsionssynthese, dadurch, dass es eine intakte, homologe Duplex-DNA als Spender verwendet, um das Reparaturereignis zu modellieren. Darüber hinaus sind viele der wichtigsten Zwischenprodukte im HR-Pfad reversibel, was eine exquisite Regulierung der einzelnen Pfadschritte ermöglicht. Während der S-, G2- und M-Phasen des Zellzyklus konkurriert HR mit NHEJ um die Reparatur der zweiseitigen DSBs1. Darüber hinaus ist HR essentiell für die DNA-Replikation für die Reparatur von replikationsassoziierten DNA-Schäden, einschließlich ssDNA-Lücken und einseitigen DSBs, und als Mechanismus des DNA-Läsionsbypasses2.
Ein kritisches Zwischenprodukt im HR-Pfad ist die Verdrängungsschleife oder D-Schleife (Abbildung 1). Nach der Endresektion lädt die zentrale Rekombinase in der Reaktion, Rad51, auf die neu resezierte ssDNA des gebrochenen Moleküls und bildet ein helikales Filament2. Rad51 führt dann eine Homologiesuche durch, um einen geeigneten homologen Spender zu identifizieren, typischerweise die Schwesterchromatide in somatischen Zellen. Die D-Schleife wird gebildet, wenn das Rad51-ssDNA-Filament in eine homologe Duplex-DNA eindringt, was zur Watson-Crick-Basenpaarung des gebrochenen Strangs mit dem komplementären Strang des Donors führt und den gegenüberliegenden Donorstrang verdrängt. Die Verlängerung des 3'-Endes des gebrochenen Strangs durch eine DNA-Polymerase ersetzt die Basen, die während des DNA-Schadensereignisses verloren gegangen sind, und fördert die Auflösung des verlängerten D-Loop-Zwischenprodukts in ein dsDNA-Produkt durch das syntheseabhängige Strangglühen (SDSA), das Doppel-Holliday-Diaphragma (dHJ) oder die Break-induzierten Replikationswege (BIR).
Assays, die die Zwischenprodukte im HR-Signalweg physisch überwachen, ermöglichen die Analyse der genetischen Anforderungen für jeden Schritt (d.h. Signalweganalyse). DSB-Bildung, Endresektion, dHJs, BIR-Replikationsblasen und HR-Produkte werden leicht durch Southern Blotting 3,4,5,6,7 beobachtet. Southern Blotting berichtet jedoch nicht über entstehende und ausgedehnte D-Schleifen, und daher ist eine alternative Methode zur zuverlässigen Messung dieser Gelenkmoleküle erforderlich 4,8,9. Eine weit verbreitete Strategie zur Analyse der entstehenden D-Loop-Bildung ist die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) von Rad51 in Verbindung mit quantitativer PCR (qPCR)10,11. Die Rad51-Assoziation mit dsDNA, gemessen mittels ChIP-qPCR, ist jedoch unabhängig von der Sequenzhomologie und dem Rad51-Akzessorfaktor Rad5410,11. Im Gegensatz dazu hängt ein nennenswertes Signal mit der hier vorgestellten Methode der D-Loop-Analyse, dem sogenannten D-Loop Capture (DLC)-Assay, von der DSB-Bildung, der Sequenzhomologie, Rad51 und den Rad51-Akzessorproteinen Rad52 und Rad548 ab. Die Feststellung, dass die von Saccharomyces cerevisiae Rad51 geförderte D-Loop-Bildung von Rad54 in vivo abhängt, stimmt mit zahlreichen In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten überein, die darauf hindeuten, dass Rad54 für die Homologiesuche und D-Loop-Bildung durch knospende Hefe Rad51 8,12,13,14,15 benötigt wird.
Ähnlich problematisch sind aktuelle Ansätze zur Messung der D-Loop-Extension, vor allem mittels semi-quantitativer PCR. Ein typischer PCR-basierter Assay zum Nachweis der D-Loop-Extension amplifiziert eine einzigartige Sequenz, die sich aus der Rekombination zwischen einer Bruchstelle und einem ektopischen Donor und der anschließenden rekombinationsassoziierten DNA-Synthese ergibt, über einen Primer stromaufwärts der Region der Homologie auf dem gebrochenen Strang und einen weiteren Primer stromabwärts der Region der Homologie auf dem Donorstrang. Mit dieser Methode erfordert der Nachweis der rekombinationsassoziierten DNA-Synthese den nicht-essentiellen Pol-δ-Prozessivitätsfaktor Pol3216. Dieser Befund steht im Widerspruch zu der Beobachtung, dass die POL32-Deletion nur einen geringen Einfluss auf die Genkonversion in vivohat 17. Darüber hinaus können diese PCR-basierten Assays die D-Loop-Erweiterung und die BIR-Produktbildung nicht zeitlich auflösen, was darauf hindeutet, dass das Signal von dsDNA-Produkten und nicht von ssDNA-Zwischenprodukten 17,18,19 stammt. Der D-loop Extension (DLE) Assay wurde kürzlich entwickelt, um diese Diskrepanzen zu beheben. Der DLE-Assay quantifiziert die rekombinationsassoziierte DNA-Synthese an einer Stelle ~400 Basenpaare (bp) stromabwärts des anfänglichen 3'-eindringenden Endes9. Bei dieser Methode ist die D-Schleifenverlängerung unabhängig von Pol32 und innerhalb von 4 h nach der DSB-Induktion nachweisbar, während BIR-Produkte zuerst nach 6 h beobachtet werden. In einer kürzlich veröffentlichten Veröffentlichung der Laboratorien Haber und Malkova wurde festgestellt, dass die Verwendung dieser Methode zur Herstellung genomischer DNA ausschließlich zur Erhaltung der ssDNA führt 9,20.
Hier werden die DLC- und DLE-Assays ausführlich beschrieben. Diese Assays beruhen auf der Proximity-Ligatur, um entstehende und ausgedehnte D-Schleifen in S. cerevisiae zu erkennen (Abbildung 2)8,9. BIR-Produkte können mit demselben Assay-System quantifiziert werden. Für beide Assays wird die DSB-Bildung an einer HO-Endonuklease-Schnittstelle am URA3-Locus auf Chromosom (Chr.) V durch die Expression der HO-Endonuklease unter der Kontrolle eines Galaktose-induzierbaren Promotors induziert. Rad51-vermittelte DNA-Stranginvasion führt zur entstehenden D-Schleifenbildung an der Stelle eines ektopischen Spenders, der sich am LYS2-Locus auf Chr. II befindet. Da die rechte Seite des DSB keine Homologie zum Spender aufweist, ist eine Reparatur über SDSA und dHJ-Bildung nicht möglich. Eine anfängliche Reparatur des DSB durch BIR ist möglich, aber die Bildung lebensfähiger Produkte wird durch das Vorhandensein desZentromers 21 gehemmt. Dieses bewusste Design verhindert eine produktive DSB-Reparatur und vermeidet so die Wiederaufnahme des Wachstums durch Zellen mit reparierten THSs, die sonst die Kultur während der Zeitverlaufsanalyse überholen könnten.
Im DLC-Assay bewahrt die psorale Vernetzung der beiden Stränge der Heteroduplex-DNA innerhalb der D-Schleife das Rekombinationszwischenprodukt. Nach der Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle am gebrochenen (resezierten) Strang und der Verdauung ermöglicht die Vernetzung die Ligation der einzigartigen Sequenzen stromaufwärts der homologen gebrochenen und Spender-DNAs. Mit Hilfe der qPCR wird der Gehalt an chimären DNA-Molekülen in jeder Probe quantifiziert. Im DLE-Assay ist keine Vernetzung erforderlich, und die Wiederherstellung und Verdauung der Restriktionsenzymstelle, gefolgt von einer intramolekularen Ligation, verbindet stattdessen das 5'-Ende des gebrochenen Moleküls mit dem neu verlängerten 3'-Ende. Auch hier wird qPCR verwendet, um die relativen Mengen dieses chimären Produkts in jeder Probe zu quantifizieren. In Abwesenheit einer Restriktionsenzymstellenwiederherstellung berichtet der DLE-Assay über die relativen Konzentrationen des BIR-Produkts (dsDNA), das nach der D-Schleifenverlängerung gebildet wird.
Repräsentative Ergebnisse für jeden Assay unter Verwendung eines Wildtypstamms werden gezeigt, und die Leser werden auf Piazza et al.8 und Piazza et al.9 verwiesen, um diese Assays für die Analyse von Rekombinationsmutanten 8,9 zu verwenden. Die Absicht dieses Beitrags ist es, anderen Laboratorien die Übernahme der DLC- und DLE-Assays zu ermöglichen, und Unterstützung für sie ist auf Anfrage erhältlich.
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Protocol
1. Vorwachstum, DSB-Induktion und Probenentnahme
HINWEIS: Die Ergänzung aller Medien mit 0,01% Adenin wird für Ade- Stämme empfohlen.
- Die entsprechenden haploiden Stämme (siehe Tabelle 1) auf Hefepeptondextroseadenin (YPDA) ( 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose, 2% Agar, 0,001% Adenin) ausstechen und 2 Tage bei 30 °C wachsen.
- Verwenden Sie eine einzelne Kolonie, um 5 ml YPDA in einem 15-ml-Glaskulturröhrchen zu impfen. Kulturen bis zur Sättigung bei 30 °C mit Schütteln oder Drehung zur Belüftung züchten.
- DLC-Assay: Bereiten Sie die 5x Psoralen-Stammlösung (0,5 mg / ml Trioxsalen in 200-prozentigem Ethanol) in einem Abzug vor, indem Sie Psoralen in einem 50-ml-konischen Röhrchen, das in Aluminiumfolie eingewickelt ist, über Nacht bei Raumtemperatur mit kontinuierlichem Schütteln oder Inversion auflösen. Versiegeln Sie den Schraubverschluss mit einer transparenten Folie, um Verdunstung zu verhindern. Bereiten Sie nicht mehr als 7 ml 5x Psoralen-Stammlösung pro 50 ml konisches Röhrchen vor, um eine ordnungsgemäße Auflösung des Psoralens zu gewährleisten.
- Verwenden Sie am nächsten Tag 5 ml der über Nacht angebauten YPDA-Kultur, um 50-100 ml YEP-Laktat (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% w/w Laktat, 0,001% Adenin) in einem angemessen großen Kolben (knospende Hefe wächst optimal in einem Kolben, der mindestens das 5-fache Volumen der Kultur hat) auf einen OD600 von ~ 0,03 zu impfen.
- Die Kultur für ~16 h bei 30 °C mit Schütteln bei 220 U/min wachsen lassen. Nach ~16 h messen Sie den OD600 der Kultur und es sollte ~ 0,5-0,8 sein. Verwenden Sie keine unter- oder überwucherten Kulturen.
- Sammeln Sie für jeden Zeitpunkt das entsprechende Zellvolumen in einem konischen Röhrchen und legen Sie es auf Eis. Typischerweise sind dies 1 x 108 Zellen (ca. 7,5 ml Kultur bei OD 600 1,0 für einen haploiden Wildtyp-Stamm) für den DLC-Assay und 5 x 107 Zellen (ca. 2,5 ml Kultur bei OD600 1,0) für den DLE-Assay.
- Um die Genauigkeit der OD 600-Werte zu gewährleisten, bereiten Sie 1:5-Verdünnungen für Kulturen mit einem OD600≥0,2 vor, um den OD-Wert bei 0,2 oder darunter zu halten. Für Wildtyp-Stämme liegen die optimalen Zeitpunkte für die DLC-Analyse zwischen 2 h und 6 h und die optimalen Zeitpunkte für die DLE-Analyse zwischen 4 h und 8 h (siehe Abbildung 3 und Abbildung 4).
- DLC-Test
- Bereiten Sie vor jedem Zeitpunkt ausreichend 1x Psoralenlösung (0,1 mg/ml Trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% Ethanol) in einem Abzug für alle Proben in einem 50 ml konischen Röhrchen vor, das in Folie eingewickelt ist. Verlassen Sie bei RT.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 ml 1x Psoralenlösung in einem Abzug und geben Sie es in eine 60 mm x 15 mm große Petrischale. Alternativ kann das Pellet in 2,5 ml TE1-Lösung (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) für eine nicht vernetzende Kontrolle resuspendiert werden.
- Vernetzen Sie die Proben. Für einen UV-Vernetzer mit langwelligen (365 nm) Lampen positionieren Sie die Petrischalen 1-2 cm unter der UV-Lichtquelle, wobei der Deckel auf einer Kunststoff- oder Plexiglasplatte entfernt wird, die bei −20° C vorgekühlt wurde. Für einen UV-Lichtkasten platzieren Sie die Petrischalen direkt auf der UV-Lichtquelle. Belichten Sie die Proben für 10 min mit leichtem Schütteln.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die UV-Lichtquelle auf einem Orbitalschüttler einzustellen, der auf ~ 50 U / min eingestellt ist. - Die Probe wird in einem Abzug in ein neues 15-ml-Röhrchen überführt. Spülen Sie die Petrischale mit 2,5 ml TE1-Lösung aus und geben Sie diese in die Röhre. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand ordnungsgemäß und lagern Sie das Pellet bei −20 ° C. Die Proben können bis zu 1 Woche gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.
- DLE-Assay
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C. Waschen Sie das Zellpellet in 2,5 ml kalter TE1-Lösung, bevor Sie den Spin wiederholen und die Pellets bei −20 °C lagern. Die Proben können bis zu 1 Woche gelagert werden, bevor sie zum nächsten Schritt übergehen.
- Für die Probenentnahme bei 0 h sammeln Sie die Proben vor der Zugabe von 20% Galaktose. Für nachfolgende Zeitpunkte induzieren Sie die DSB-Bildung, indem Sie den Kulturen 20% Galaktose zu einer Endkonzentration von 2% hinzufügen. Sammeln Sie die restlichen Proben wie oben beschrieben, pelletieren und frieren Sie relativ zur Zeit nach der DSB-Induktion ein (d. h. die 4-stündige Probe wird 4 h nach Zugabe von 20% Galaktose entnommen).
2. Zellsphäroplasting, Lyse und Wiederherstellung der Restriktionsstelle
- Die Proben auf Eis auftauen. Ein trockenes Bad auf 30 °C vorheizen.
- Die Proben werden in 1 mL Sphäroplastierpuffer (0,4 M Sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) resuspendiert und in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
- Fügen Sie 3,5 μL Zymolyaselösung hinzu (2% Glucose, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml Zymolyase 100T; 17,5 μg/ml Zymolyase Endkonzentration). Mischen Sie vorsichtig durch Klopfen oder Inversion. Bei 30 °C 15 min inkubieren und dann auf Eis legen. Während der 15-minütigen Inkubation erhalten Sie flüssigen Stickstoff oder Trockeneis.
- 3 min bei 2.500 x g bei 4 °C zentrifugieren und die Proben auf Eis legen. Waschen Sie die Proben 3x in 1 ml Sphäroplastierpuffer. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 2.500 x g bei 4 °C.
- Resuspendieren Sie die Proben in 1 ml kaltem 1x Restriktionsenzympuffer (50 mM Kaliumacetat, 20 mM Trisacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 100 μg/ml BSA pH ~8,0 bei RT) und zentrifugieren Sie für 3 min bei 16.000 x g bei 4 °C. Legen Sie die Proben auf Eis. Wiederholen Sie die Wäsche 1x.
- Resuspendieren Sie die Proben in 1 ml kaltem 1x Restriktionsenzympuffer. Teilen Sie die Probe (jeweils 0,5 ml) in zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 16.000 x g bei 4 °C.
- Resuspendieren Sie ein Röhrchen aus jeder Probe in 180 μL 1,4x Restriktionsenzympuffer mit hybridisierenden Oligos (siehe Tabelle 2) und ein Röhrchen in 180 μL 1,4x Restriktionsenzympuffer ohne hybridisierende Oligos. Jedes hybridisierende Oligo wird in 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) resuspendiert und in einer Endkonzentration von 7 nM verwendet. Der 1x TE ersetzt die hybridisierenden Oligos im 1,4x Restriktionsenzympuffer ohne hybridisierende Oligos.
HINWEIS: Die hybridisierenden Oligos müssen bei −20 °C in kleinen Aliquoten bei der Arbeitsverdünnung gelagert werden. Die Konzentration der hybridisierenden Oligos kann optimiert werden müssen; siehe Diskussion. - Die Proben werden in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis/Ethanol eingefroren und bei −80 °C gelagert. Proben können in diesem Stadium für mehrere Monate gelagert werden.
3. Restriktionsenzymverdau und intramolekulare Ligation
- Die Proben auf Eis auftauen. Ein trockenes Bad auf 65 °C und ein weiteres auf 37 °C vorheizen.
- 36 μL der Probe werden in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis geleitet. Die restliche Probe wird umgehend zur Lagerung auf −80 °C zurückgebracht.
- Fügen Sie 4 μL 1% SDS (0,1% Endkonzentration) hinzu und mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf die Seite des Röhrchens klopfen. Bei 65 °C 15 min mit leichtem Klopfen alle 5 min inkubieren. Legen Sie die Proben unmittelbar nach der Inkubation auf Eis.
HINWEIS: Diese SDS-Behandlung fördert die Denaturierung von DNA-assoziierten Proteinen, die Solubilisierung der Kernhülle und die Chromatinzugänglichkeit vor dem Restriktionsenzymverdau und den intramolekularen Ligationsschritten. - Fügen Sie 4,5 μL 10% Triton X-100 (1% Endkonzentration) hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. Zu jeder Probe 20-50 U Restriktionsenzym (EcoRI-HF oder HindIII-HF) geben und bei 37 °C 1 h unter leichtem Rühren alle 20-30 min inkubieren. Während dieser Zeit ein trockenes Bad auf 55 °C und ein Wasserbad auf 16 °C vorheizen.
- Fügen Sie 8,6 μL 10% SDS (1,5% Endkonzentration) zu jeder Probe hinzu und mischen Sie durch Pipettieren und Klopfen. Bei 55 °C 10 min inkubieren. Fügen Sie 80 μL 10% Triton X-100 (6% Endkonzentration) zu jeder Probe hinzu und mischen Sie durch Pipettieren.
- 660 μL 1x Ligationspuffer ohne ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA-Ligase (8 U/Probe) zu jeder Probe zugeben und durch sanfte Inversion mischen. Inkubieren bei 16 °C für 1,5 h mit Inversion alle 30 min. Legen Sie die Proben unmittelbar nach der Inkubation auf Eis.
4. DNA-Reinigung
- Ein trockenes Bad auf 65 °C und ein weiteres auf 37 °C vorheizen. Zu jeder Probe (12,5 μg/ml Endkonzentration) 10 mg/ml Proteinase K (hergestellt in 1x TE pH 8,0) zugeben. Bei 65 °C 30 min inkubieren und die Proben unmittelbar nach der Inkubation auf Eis legen, bis sie abgekühlt sind.
- Die Proben werden in 2-ml-Röhrchen überführt. In einem Abzug arbeiten und jeder Probe ein gleiches Volumen (~ 800 μL) Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (p / c / ia; pH 8,0) hinzufügen. Wirbeln Sie die Proben für ~30 s und zentrifugieren Sie die Proben für 5-10 min bei 16.000 x g in einer Mikrozentrifuge.
- Entfernen Sie vorsichtig 600 μL der oberen Phase jeder Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Entsorgen Sie die untere Phase und 2 ml Röhrchen ordnungsgemäß.
- Fällung der DNA, indem Sie jeder Probe ein 1/10-Volumen von 3 M Natriumacetat pH 5,2 (~ 60 μL) hinzufügen, gefolgt von 1 Volumen Isopropanol (~ 660 μL). Invertieren Sie die Proben 5x-10x und inkubieren Sie bei RT für 30 min.
- Legen Sie die Proben für 2 min auf Eis und zentrifugieren Sie dann die Proben bei 16.500 x g für 15 min bei 4 °C in einer Mikrozentrifuge. Bringen Sie die Proben zu Eis zurück, gießen Sie den Überstand ab und lassen Sie das Röhrchen auf einem Papiertuch abtropfen.
- Waschen Sie das DNA-Pellet mit 200 μL 70% Ethanol. Bei 16.500 x g 3 min bei 4 °C zentrifugieren, die Proben wieder auf Eis legen, den Überstand abgießen und den Restalkohol mit einem Pipet entfernen. Trocknen Sie die Proben mit offenen Kappen der Röhrchen bei 37 °C für 15-20 min.
- Resuspendieren Sie die DNA-Pellets in 50 μL 1x TE durch Wirbeln. Bei RT 30 min inkubieren, Wirbel und dann bei 37 °C in einem trockenen Bad 30 min inkubieren. Wirbeln Sie die Proben erneut aus und legen Sie sie dann auf Eis. Die Proben können in diesem Stadium bei −20 °C für mehrere Monate gelagert werden, aber es ist ratsam, sofort mit den Decrosslinking- (nur DLC) und qPCR-Schritten fortzufahren.
5. Psoralen-Crosslink-Umkehrung (nur für DLC-Assay)
- Pipet 9 μL gereinigte DNA in ein PCR-Röhrchen auf Eis. 1 μL 1 M KOH (0,1 M Endkonzentration) zugeben. Inkubieren Sie die Proben bei 90 °C für 30 min in einem Thermocycler.
- Fügen Sie 19,73 μL Natriumacetatlösung hinzu (0,1 M Natriumacetat, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Proben können in diesem Stadium bei −20 °C für mehrere Monate gelagert werden, aber es ist ratsam, sofort mit dem qPCR-Schritt fortzufahren.
6. Quantitative PCR, Kontrollen und Analyse
- Unter Verwendung von 2 μL gereinigter DNA, mit oder ohne Vernetzung, wird eine 20 μL qPCR-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers eingerichtet. Richten Sie jede Reaktion doppelt ein. Sowohl für den DLC- als auch für den DLE-Assay gibt es fünf Kontrollreaktionen und eine DLC/DLE-Quantifizierungsreaktion oder insgesamt sechs Reaktionen pro Probe, die in doppelter Ausführung durchgeführt werden. Die Zusatztabelle S1 und die Zusatztabelle S2 bieten eine Vorlage für die Einrichtung dieser Reaktionen und Analysen, und die Sequenzen der qPCR-Primer sind in Tabelle 3 aufgeführt.
- Die qPCR-Zyklusbedingungen müssen für jedes qPCR-Kit optimiert werden.
- Verwenden Sie die folgenden DLC qPCR-Bedingungen, abhängig von den verwendeten qPCR-Kits: anfängliche Denaturierung (95 °C für 3 min); 50 Schuss Verstärkung (95 °C für 15 s, 61 °C für 25 s, 72 °C für 15 s mit einer einzigen Erfassung); Schmelzkurvenanalyse (95 °C für 5 s, 65 °C für 1 min, 97 °C mit kontinuierlicher Erfassung); und Kühlung (37 °C für 30 s).
- Verwenden Sie die folgenden qPCR-Bedingungen für den DLE-Assay: anfängliche Denaturierung (95 °C für 5 min); 50 Schuss Verstärkung (95 °C für 15 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 15 s mit einer einzigen Erfassung); Schmelzkurvenanalyse (95 °C für 5 s, 65 °C für 1 min, 97 °C mit kontinuierlicher Erfassung); und Kühlung (37 °C für 30 s). Beachten Sie, dass eine Optimierung für verschiedene qPCR-Maschinen/Kits erforderlich sein kann.
- DLC-Test
- Kontrollen: Siehe Liste der qPCR-Primer in Tabelle 3. Eine Karte der Primerbindungsstellen ist in Abbildung S1 dargestellt. Ergänzende Sequenzdateien für die relevanten genomischen Merkmale und Amplikone finden Sie in den ApE-Dateien (A plasmid Editor); Ergänzende Sequenzdateien 1-5.
- Genomische DNA bei ARG4: Verwenden Sie olWDH1760/olWDH1761, um dsDNA bei ARG4 zu amplifizieren. Verwenden Sie diese Reaktion als Ladesteuerung und normalisieren Sie alle anderen Reaktionen mit Ausnahme der DLC-Signalreaktion auf diese Steuerung.
- Intramolekulare Ligationseffizienz bei DAP2: Verwenden Sie das 1.904 bp-Fragment, das durch den EcoR-I-Aufschlusserzeugt wurde, für die intramolekulare Ligation parallel zur DLC-Ligation. Die Amplifikation über diesen Ligationsübergang berichtet über die intramolekulare Ligationseffizienz und dient als Kontrolle, auf die das DLC-Signal normalisiert wird.
- DSB-Induktion: Verwenden Sie olWDH1766/olWDH1767, um einen Bereich zu verstärken, der den induzierten DSB überspannt.
- Psoralen-Vernetzung und -Resektion: Verwenden Sie olWDH2019/olWDH2020, um die einzigartige PhiX-Region stromabwärts der EcoRI-Erkennungsstelle zu verstärken. Verwenden Sie ohne Crosslink-Umkehrung das Verhältnis der ssDNA (keine Vernetzung) zu ARG4 (vernetzte dsDNA), um die Vernetzungseffizienz zu bestimmen. Bei der Crosslink-Umkehrung führt die Resektion zu einer progressiven Abnahme des Signals von 1 auf 0,5 relativ zu ARG4.
- EcoR I-Erkennungsstelle Wiederherstellung und Schnitt: Verwenden Sie olWDH1768/olWDH1764, um einen Bereich zu verstärken, der die restaurierte EcoRI-Erkennungsstelle stromaufwärts des DSB auf dem resezierten Strang überspannt. olWDH1769/olWDH1763 verstärken eine Region, die sich über die EcoRI-Restriktionsenzymstelle bei DAP2 erstreckt. Führen Sie an dieser Stelle eine EcoRI-Spaltung durch, um sie als intramolekulare Ligationskontrolle zu verwenden.
- DLC-Signal: Verwenden Sie olWDH1764/olWDH1765, um das chimäre DNA-Molekül zu amplifizieren, das durch intramolekulare Ligation des resezierten (eindringenden) Strangs und des Donors erzeugt wird.
- Analyse: Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Cp-Werte für jede der doppelten Reaktionen. Verwenden Sie die genomischen ARG4-DNA-qPCR-Cp-Werte als Referenz, um alle anderen Kontroll-qPCRs zu normalisieren. Normalisieren Sie das DLC-Signal zur intramolekularen Ligationskontrolle bei DAP2. Siehe Abbildung 3 für typische DLC-Signalwerte bei 2 h.
- Kontrollen: Siehe Liste der qPCR-Primer in Tabelle 3. Eine Karte der Primerbindungsstellen ist in Abbildung S1 dargestellt. Ergänzende Sequenzdateien für die relevanten genomischen Merkmale und Amplikone finden Sie in den ApE-Dateien (A plasmid Editor); Ergänzende Sequenzdateien 1-5.
- DLE-Assay
- Kontrollen: Siehe Liste der qPCR-Primer in Tabelle 3. Eine Karte der Primerbindungsstellen ist in Abbildung S1 dargestellt. Ergänzende Sequenzdateien für die relevanten genomischen Merkmale und Amplikone finden Sie in den A-Plasmid-Editor-Dateien (ApE) (Supplementary Sequence Files 1-5).
- Genomische DNA bei ARG4: Siehe Abschnitt 6.3.1.1.
- Intramolekulare Ligationseffizienz bei YLR050C: Verwenden Sie den HindIII-Aufschluss, um ein 765-bp-Fragment zu erzeugen, das parallel zur DLE-Ligation einer intramolekularen Ligation unterzogen wird. Die Amplifikation über diesen Ligationsübergang berichtet über die intramolekulare Ligationseffizienz und dient als Kontrolle, auf die das DLE-Signal normalisiert wird.
- DSB-Induktion: Siehe Abschnitt 6.3.1.3.
- Hirschkuh Wiederherstellung und Schneiden der III-Erkennungsstelle: Verwenden Sie olWDH2010/olWDH2012 und olWDH2009/2011, um eine Region zu amplifizieren, die die HindIII-Restriktionsenzymstellen auf dem gebrochenen Strang überspannt, wo sie reseziert bzw. verlängert wurde.
- DLE-Signal: Verwenden Sie olWDH2009/olWDH2010, um das chimäre DNA-Molekül zu amplifizieren, das durch intramolekulare Ligation des resezierten Endes des eindringenden Strangs stromaufwärts des DSB zum neu verlängerten Ende stromabwärts des DSB erzeugt wird.
- Analyse: Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Cp-Werte für jede der doppelten Reaktionen. Verwenden Sie die genomischen ARG4-DNA-qPCR-Cp-Werte als Referenz, um alle anderen Kontroll-qPCRs zu normalisieren. Normalisieren Sie das DLE-Signal zur intramolekularen Ligationskontrolle bei YLR050C. Typische DLE-Signalwerte bei 6 h sind in Abbildung 4 und früheren Publikationen9 dargestellt.
- Kontrollen: Siehe Liste der qPCR-Primer in Tabelle 3. Eine Karte der Primerbindungsstellen ist in Abbildung S1 dargestellt. Ergänzende Sequenzdateien für die relevanten genomischen Merkmale und Amplikone finden Sie in den A-Plasmid-Editor-Dateien (ApE) (Supplementary Sequence Files 1-5).
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Representative Results
DLC-Test
Der DLC-Assay erkennt sowohl entstehende als auch ausgedehnte D-Schleifen, die durch die Invasion eines standortspezifischen DSB in einen einzelnen Donor gebildet werden (Abbildung 2). Die Psoralenvernetzung verbindet den gebrochenen Strang und den Spender physikalisch über die heteroduplexe DNA innerhalb der D-Schleife. Die Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle mit einem langen, hybridisierenden Oligo auf dem resezierten Strang des Bruchs ermöglicht eine Restriktionsenzymspaltung, gefolgt von der Ligation des gebrochenen Strangs zum proximalen Donor, um ein chimäres Produkt zu bilden, das durch qPCR quantifiziert wird. Insbesondere hängt das DLC-Signal von der Psoralenvernetzung, dem hybridisierenden Oligo, der zentralen Rekombinase, Rad51 und den Rad51-Akzessorfaktoren Rad52 und Rad548 ab. Die Deletion der DNA-Helikasen/Topoisomerasen Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 und Srs2 führt zu einem erhöhten DLC-Signal.
Abbildung 3 zeigt die repräsentativen Ergebnisse für den Standard-Wildtypstamm bei 2 h Post-DSB-Induktion in dreifacher Ausfertigung mit und ohne hybridisierendem Oligo. Eine Probe, der ein Schlüsselschritt fehlt, die Psoralenvernetzung, wird ebenfalls doppelt gezeigt.
Wie in Abbildung 3 dargestellt, ist die Psoralenvernetzung ein kritischer Schritt. Es gibt praktisch kein erkennbares Signal ohne es8. Die Vernetzungseffizienz wird anhand des Verhältnisses von ssDNA zu dsDNA-Amplifikation gemessen. Im Gegensatz zu dsDNA erfährt ssDNA eine minimale Psoralen-Vernetzung, und daher zeigt ein hohes Signal eine erfolgreiche Vernetzung an. Die Vernetzungseffizienz variiert je nach Zeit zwischen der Probenentnahme und der Vorbereitung für die qPCR (Abbildung 3, unten links). Je mehr Zeit zwischen Probenentnahme und Vorbereitung liegt, desto weniger Signal wird für die Vernetzungseffizienz qPCR-Kontrolle beobachtet. Eine signifikante Variation des Signals zwischen den Stichproben, die für die Vernetzungseffizienz der qPCR-Kontrolle beobachtet wurde, gibt Anlass zur Sorge, und der Zeitverlauf sollte verworfen werden.
ARG4 Die Cp-Werte sind zwischen den mit- und ohne hybridisierenden Oligoproben ähnlich (Abbildung 3, oberes linkes Feld). Ein niedriger Cp-Wert zeigt an, dass mehr amplifizierbare DNA vorhanden ist. Dies erklärt, warum die ARG4-Cp-Werte für die ohne Vernetzung befindlichen Proben deutlich niedriger sind: Die Vernetzung stört die qPCR-Amplifikation. Dieser Unterschied zwischen den mit- und ohne-vernetzenden Proben gilt für alle qPCRs mit Ausnahme der EcoRI-Spaltungs-qPCR-Kontrolle, die ssDNA/nicht-vernetzte dsDNA amplifiziert. Alle qPCR-Kontrollen, aber nicht das DLC-Signal, sind auf das ARG4-qPCR-Signal normiert.
Für alle Proben liegt die intramolekulare Ligations-qPCR-Kontrolle im entsprechenden Bereich (Abbildung 3, oberes mittleres Bild), und es gibt eine robuste DSB-Induktion, wie das niedrige Signal für die qPCR-Kontrolle zeigt, das sich über die HO-Endonuklease-Erkennungsstelle verstärkt (Abbildung 3, oben rechts). In den mithybridisierenden Oligoproben wird ein effizientes EcoRI-Schneiden beobachtet, und diese qPCR-Kontrolle gibt ein schwaches Signal (Abbildung 3, unteres mittleres Bild). Umgekehrt geben die ohne Hybridisierung hybridisierenden Oligo-mit-Vernetzungsproben ein hohes Signal, ähnlich dem, was für die Vernetzungseffizienz qPCR-Kontrolle gezeigt wird, da in diesem Fall ungeschnittene ssDNA amplifiziert und zum ARG4-qPCR-Signal (dsDNA) normalisiert wird.
Im Gegensatz zu den anderen qPCRs ist das qPCR-Signal für den DLC-Assay auf die intramolekulare Ligation qPCR-Kontrolle normiert, da das durch die DLC qPCR quantifizierte chimäre Molekül von der Ligation abhängt. Das mediane DLC-Signal bei 2 h mit hybridisierendem Oligo beträgt 0,030 ± 0,0055 (Abbildung 3, unten rechts), was den zuvor veröffentlichten Ergebnissen für diesen Assay8 entspricht. Wie erwartet, hängt dieses Signal sowohl von der hybridisierenden Oligo- als auch von der Psoralenvernetzung ab.
DLE-Assay
Der DLE-Assay ermöglicht die genaue Überwachung der D-Loop-Erweiterung als Reaktion auf eine standortspezifische DSB (Abbildung 2). Es wurde bereits gezeigt, dass das DLE-Signal von Rad51 abhängt, der zentralen Rekombinase in der Reaktion, die die Stranginvasion vermittelt und daher für die rekombinationsassoziierte DNA-Synthese benötigtwird 9. Darüber hinaus hängt das DLE-Signal von der katalytischen Untereinheit von Pol δ, Pol3 (DR, AP, WDH, unveröffentlichte Daten) ab, nicht aber vom nicht-essentiellen Prozessivitätsfaktor Pol32. Im Gegensatz zum DLC-Signal, das erst 2 h nach der DSB-Induktion nachweisbar wird, nimmt das DLE-Signal erst 4 h nach der DSB-Induktion merklich zu, steigt zwischen 4 h und 6 h dramatisch an und beginnt danach ein Plateau zu erreichen, wobei ein Großteil des Signalanstiegs zwischen 6 h und 8 h auf die BIR-Produktbildung zurückzuführenist 8. 9.
Da das im DLE-Assay quantifizierte chimäre Ligationsprodukt einzelsträngig ist, ist der Schritt der Zellsphäroplastierung und -lyse von entscheidender Bedeutung. Ein vermindertes DLE-Signal kann aus Problemen mit diesem Schritt resultieren, die Nukleasen freisetzen und zum Abbau der Ziel-ssDNA führen können.
Abbildung 4 zeigt repräsentative Ergebnisse für den Standard-Wildtypstamm bei 6 h nach DSB-Induktion in dreifacher Ausfertigung mit und ohne hybridisierende Oligos. Die Wildtypprobe ohne hybridisierende Oligos repräsentiert allein das dsDNA-BIR-Produkt, während das with-oligo-Signal sowohl von der ssDNA der erweiterten D-Schleife als auch vom dsDNA-BIR-Produkt abgeleitet wird. Eine dritte Stichprobe ist als Beispiel für ein fehlgeschlagenes Experiment enthalten.
ARG4 Die Cp-Werte waren zwischen den mit- und ohne hybridisierenden Oligoproben ähnlich (Abbildung 4, oberes linkes Bild). ARG4 Die Cp-Werte waren für die fehlgeschlagene Probe deutlich niedriger, was darauf hindeutet, dass diese Probe mehr genomische DNA aufweist als die erfolgreichen Proben. Die qPCR-Signale für die qPCR-Kontrollen, aber nicht das DLE-Signal, wurden auf das ARG4-qPCR-Signal normiert. Die intramolekulare Ligations-qPCR-Kontrolle zeigte ein akzeptables Signal für die mit- und ohne-hybridisierenden Oligoproben (zwischen ~0,15-0,35), aber ein wesentlich geringeres Signal für die fehlgeschlagene Probe (Abbildung 4, oberes mittleres Bild). In dieser fehlgeschlagenen Probe führte die hohe Menge an genomischer DNA, die von der ARG4 qPCR-Kontrolle angezeigt wurde, wahrscheinlich zum Versagen der intramolekularen Ligation, da eine hohe Konzentration genomischer DNA zu einer intermolekularen Ligation führt.
In allen drei Proben gab es eine robuste DSB-Induktion (Abbildung 4, oben rechts). Hirschkuh III-Spaltung sowohl an den resezierten als auch an den verlängerten Strängen hängt vom Vorhandensein der hybridisierenden Oligos ab. Auf dem verlängerten Strang kommt es zusätzlich auf die D-Schleifenverlängerung an. So gab es einen signifikanten Unterschied in der Amplifikation über die Hind III-Spaltstelle auf dem resezierten Strang zwischen den With- und Without-Oligo-Proben (Abbildung 4, unten links) und einen kleineren Unterschied in der Amplifikation über die HindIII-Erkennungsstelle auf dem verlängerten Strang zwischen diesen Proben (Abbildung 4, unteres mittleres Bild).
Da das DLE-Signal von der intramolekularen Ligation abhängt, wird es auf die intramolekulare Ligation qPCR-Kontrolle normiert. Das mediane DLE-Signal bei 6 h mit hybridisierenden Oligos betrug 0,53 ± 0,17 (Abbildung 4, unten rechts), was mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen für diesen Assay9 übereinstimmt. Das DLE-Signal für die Wildtyp-Probe ohne hybridisierende Oligos war ähnlich kompatibel mit dieser früheren Veröffentlichung. Das DLE-Signal war niedriger als erwartet für die fehlgeschlagene Stichprobe, was wahrscheinlich die oben genannten Probleme mit dieser Stichprobe widerspiegelt.
Crosslink-Umkehrung
Psoralen, das zwischen ApT/TpA-Basenpaaren in dsDNA interkaliert ist, kann durch seine Furan- und Pyronringe kovalent mit einer oder beiden entgegengesetzten Thyminbasen bei UV-Bestrahlung verknüpft werden, was zu (überwiegend Furan-)Monoaddukten bzw. Interstrang-Diaddukten (d.h. Vernetzungen) führt22. Es wird erwartet, dass diese Modifikationen das Fortschreiten der DNA-Polymerase blockieren und so die DNA-Synthesereaktion hemmen, die für die quantitative PCR unerlässlich ist. Folglich können die meisten dsDNA-Templates nicht amplifiziert werden (Abbildung 5A,B). Im Gegensatz dazu macht das Fehlen von Basenpaaren in ssDNA es weniger anfällig für Psoralen-Crosslinking. Es wird daher leichter amplifiziert als dsDNA, was die relative Quantifizierung von ssDNA gegenüber dsDNA und von dsDNA-Amplicons unterschiedlicher Länge und ApT/TpA-Gehalt verzerrt (Abbildung 5A,B). Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde vor der quantitativen PCR eine basen- und hitzekatalysierte Umkehrung der Psoralen-Crosslink-Umkehrschritt23 angewendet. Diese Methode lässt nur die kleinere Art der Pyronseitenmonoaddukte23,24 übrig. Es führte zu einer 80-fachen Erholung genomischer dsDNA- und intramolekularer Ligationskontrollamplikone, was darauf hindeutet, dass die große Mehrheit der Template-Moleküle mindestens ein furanseitiges Monoaddukt oder eine Interstrangvernetzung aufwies (Abbildung 5B,C). Der Vergleich der Cp-Werte der dsDNA-genomischen DNA-Kontrolle vor und nach der Quervernetzungsumkehr liefert eine Schätzung der Vernetzungseffizienz, die in dem hier gezeigten Bereich liegen sollte. Neben kurzen Amplikonen kann dieses Verfahren Vorlagen mit einer Länge von bis zu 3 KB wiederherstellen (Abbildung S2). Für das ssDNA-Amplikon wurde keine Veränderung beobachtet, was mit einem Mangel an Psoralen-Vernetzung zu ssDNA übereinstimmt (Abbildung 5B-D). Es zeigt auch, dass das Crosslink-Reversal-Verfahren DNA23 nicht nachweisbar schädigt. Die Wiederherstellung des DLC-Chimärenamplikon, das ein vernetztes dsDNA-Segment enthält, das an ein nicht vernetztes ds-ssDNA-Segment (50 bp und 118 bp/nt; Abbildung 5A) war intermediär zu dem von dsDNA- und ssDNA-Amplikonen, mit einer 8-fachen Verbesserung der Erholung (Abbildung 5B,C). Die Crosslink-Umkehrung hatte keinen Einfluss auf die relativen Spiegel der beiden dsDNA-Amplikone, wobei die intramolekulare Ligationskontrolle im Bereich von 0,2-0,25 relativ zur genomischen DNA-Kontrolle blieb (Abbildung 5E). Es änderte jedoch die relative Menge des ssDNA-Amplikons relativ zur dsDNA-genomischen DNA-Kontrolle von einem 40-fachen Überschuss auf das 0,5-fache, das für eine ssDNA relativ zu einer dsDNA-Vorlage erwartet wird (Abbildung 5D). Ebenso verringerte sich das teilweise ssDNA-DLC-Signal von 6,6 x 10−2 auf 6,6 x 10−3 relativ zu den intramolekularen dsDNA-Ligationskontrollen (Abbildung 5F). Dies führt uns zu der Schätzung der Anzahl der D-Loop-Gelenkmoleküle an einem interchromosomalen Spender, der mit diesem Ansatz 4 h nach der DSB-Induktion nachgewiesen wurde, auf durchschnittlich 1,3% der gesamten gebrochenen Moleküle in der Zellpopulation. Solche absoluten Schätzungen konnten nicht mit einer psoralenbasierten Verzerrung von dsDNA und ssDNA-Amplifikation vorgenommen werden, was den Wert dieses zusätzlichen Vernetzungsumkehrschritts unterstreicht.
Abbildung 1: Homologe Rekombinations- und Auflösungssubpfade. Nach DNA-Schäden, die zu einem ein- oder zweiseitigen DSB (gezeigt) oder einer ssDNA-Lücke führen, zeigt die 5' bis 3' Resektion der DNA-Enden 3' ssDNA-Überhänge, auf denen sich das Rad51-Filament bildet, unterstützt durch seine akzessorischen Faktoren. Rad51 durchsucht dann das Genom nach einer intakten Duplex-DNA (d.h. dem Spender), auf der das Reparaturereignis abgebildet werden kann. Dieser Prozess gipfelt in der DNA-Stranginvasion, bei der sich der gebrochene Strang Watson-Crick-Base mit dem komplementären Strang des doppelsträngigen DNA-Spenders paart, den gegenüberliegenden Strang verdrängt und die entstehende D-Schleife bildet. Diese D-Schleife kann entweder umgekehrt werden, damit die Rad51-Homologiesuche einen anderen Donor auswählen kann, oder um eine DNA-Polymerase erweitert werden, um die Basen zu ersetzen, die während des DNA-Schadensereignisses verloren gegangen sind. Drei HR-Subpfade stehen zur Verfügung, um dieses erweiterte D-Loop-Zwischenprodukt in ein Produkt aufzulösen. Erstens kann der verlängerte D-Kreislauf durch eine Helikase unterbrochen werden, so dass das neu verlängerte Ende des Bruchs zum zweiten Ende in einem Prozess, der als syntheseabhängiges Strangglühen (SDSA) bezeichnet wird, geglüht werden kann. Fill-in-DNA-Synthese und Ligatur führen dann zur Produktbildung. Alternativ kann das zweite Ende des Bruchs zum verdrängten Spenderstrang glühen und eine Doppel-Holliday-Verbindung (dHJ) bilden. Die nukleolytische Auflösung des dHJ führt entweder zu einem Crossover (CO) oder Nicht-Crossover (NCO), während die dHJ-Auflösung (nicht gezeigt) nur zu NCO-Produkten führt. Schließlich führt das Versäumnis, das zweite Ende des DSB zu aktivieren, zur bruchinduzierten Replikation (BIR), einem mutagenen Prozess, bei dem Tausende von Basenpaaren vom Donor auf den gebrochenen Strang kopiert werden. Dieser Prozess kann sich bis zur konvergierenden Replikationsgabel oder zum Ende des Chromosoms erstrecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Prämisse der Produktbildungsassays D-Loop Capture (DLC), D-Loop Extension (DLE) und Break-induced Replication (BIR). Die DSB-Bildung wird durch eine ortsspezifische Endonuklease unter der Kontrolle des GAL1-Promotors angetrieben. Die DSB-Induktion führt zur Bildung einer entstehenden D-Schleife. Im DLC-Assay bewahrt die Interstrangvernetzung der DNA diese Struktur, die dann extrahiert wird. Die Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle wird durch Hybridisierung mit einem langen Oligonukleotid erreicht, und dann wird die DNA verdaut und ligiert, um ein Produkt zu bilden, das durch quantitative PCR (qPCR) quantifiziert werden kann. Der DLE-Assay unterscheidet sich dadurch, dass die DNA nicht vernetzt ist und sich stattdessen das intramolekulare Ligationsprodukt zwischen den beiden Enden der ssDNA auf einer Seite des Bruchs bildet, wobei das 3'-Ende durch eine DNA-Polymerase verlängert wurde. qPCR wird wiederum verwendet, um die Bildung des chimären Ligationsprodukts zu quantifizieren. Der Nachweis der D-Loop-Extension über den DLE-Assay erfordert ebenfalls eine Restriktionsenzym-Site-Restauration. Im Gegensatz dazu wird das doppelsträngige BIR-Produkt mit den DLE-Assay-Primern ohne die hybridisierenden Oligonukleotide nachgewiesen. R zeigt an, dass eine Restriktionsenzymstelle für die Enzymspaltung zuständig ist; (R) zeigt eine Restriktionsenzymstelle an, die nicht geschnitten werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der DLC-Assay-Analyse von D-Schleifen bei 2 h nach DSB-Induktion. Die Proben wurden wie in diesem Protokoll beschrieben mittels qPCR gesammelt, aufbereitet und analysiert. Blaue Symbole stellen die Ergebnisse für den Standard-Wildtypstamm mit hybridisierenden Oligos für n = 3 dar. Grüne Symbole stellen Ergebnisse für den Wildtypstamm dar, ohne hybridisierende Oligos für n = 3 zu hybridisieren. Die dicke rote Linie zeigt den Median. Die violetten Symbole repräsentieren Proben ohne Psoralenvernetzung, aber mit hybridisierenden Oligos für n = 2. Symbole zeigen an, dass die Proben aus derselben Kultur stammen. Interexperimentelle Unterschiede in der Vernetzungseffizienz können Variabilität in bestimmte qPCR-Kontrollen einführen, sind aber nicht problematisch, solange es keine Variabilität zwischen den Stichproben in diesen qPCR-Kontrollen innerhalb eines Experiments gibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der DLE-Assay-Analyse 6 h nach DSB-Induktion. Die Proben wurden wie in diesem Protokoll beschrieben mittels qPCR gesammelt, aufbereitet und analysiert. Blaue Symbole stellen die Ergebnisse für den Standard-Wildtypstamm mit hybridisierenden Oligos für n = 3 dar. Grüne Symbole stellen Ergebnisse für den Wildtypstamm dar, ohne hybridisierende Oligos für n = 3 zu hybridisieren. Die dicke rote Linie zeigt den Median. Beachten Sie, dass die Oligoproben mit und ohne Hybridisierung aus denselben Kulturen stammen. Der violette Diamant stellt eine fehlgeschlagene Probe ohne hybridisierende Oligos für n = 1 dar. Symbole zeigen an, dass die Proben aus derselben Kultur stammen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse der Psoralen-Vernetzungsumkehr . (A) Psoralen-DNA-Monoaddukte (*) und Interstrang-Crosslinks (X) treten spezifisch auf dsDNA auf und verhindern ihre Amplifikation durch DNA-Polymerasen im Gegensatz zu ssDNA-Vorlagen. Dieser Unterschied führt zu einer Verzerrung bei der Quantifizierung von dsDNA- und ssDNA-haltigen Templates mittels qPCR. Diese Verzerrung kann durch Umkehrung der Psoralen-Vernetzung überwunden werden. (B) Repräsentative Cp-Werte von dsDNA (genomisch, Ligation), ssDNA und gemischten ds-ssDNA (DLC)-Amplikonen, die 4 Stunden nach der DSB-Induktion erhalten wurden. Die Daten stellen einzelne Werte und den Median von vier biologischen Replikaten dar. (C) Amplifikationsrückgewinnung bei Querlenkerumkehr, berechnet anhand der Cp-Werte in (B). (D) Die ssDNA-Amplifikation relativ zur genomischen dsDNA-Kontrolle mit und ohne Psoralen-Vernetzungsumkehr. Bei Umkehrung amplifiziert sich das ssDNA-Amplikon bei den erwarteten 0,5 der genomischen dsDNA-Kontrolle. (E) Die intramolekulare dsDNA-Ligationskontrolle relativ zur genomischen dsDNA-Kontrolle mit und ohne Psoralen-Vernetzungsumkehr. (F) Das DLC-Signal relativ zur dsDNA-Ligationskontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Aktuelles DLC/DLE-Assay-System und die vorgeschlagenen Modifikationen. Oben: Die aktuelle DLC/DLE-Testbruchstelle und der Spender sind dargestellt. Unten: Geplante Änderungen an der DLC/DLE-Analysestelle und am Spender. (I) Die 117 bp HO-Endonuklease-Schnittstelle ist gelb markiert. Um Störeffekte bei der Überwachung der D-Schleifenstörung zu vermeiden, wird die linke Seite des HOcs (74 bp) in den Donor eingeführt, so dass die Rekombination zwischen den beiden eine perfekt abgestimmte D-Schleife ohne 3'-Klappe erzeugt. (II) Um das System reparierbar und damit physiologischer zu machen, wird DNA, die homolog zum Spender ist (in Blaugrün und Flieder angegeben), in die rechte Seite des HOcs eingefügt. (III) Das Eindringen und die Ausdehnung durch den Strang rechts vom HOcs werden anhand von Sequenzen überwacht, die für diese Seite des Bruchs einzigartig sind (orange dargestellt). (IV) Zusätzliche gleichmäßig verteilte Restriktionsenzymstellen und -sequenzen, die für den Spender einzigartig sind, ermöglichen es, die D-Loop-Erweiterung (durch Invasion von der linken Seite der HOcs) an weiter entfernten Stellen zu überwachen. In diesem modifizierten System kann es an den in Blaugrün oder Flieder gezeigten Stellen zu syntheseabhängigem Strangglühen (SDSA) oder Doppel-Holliday-Diaphragma (dHJ) kommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung S1: Karte der qPCR-Primer, die in den DLC- und DLE-Assays verwendet werden. Karte der genomischen Loci, die für die Analyse in den DLC- und DLE-Assays verwendet werden, ihrer relevanten Merkmale und der ungefähren Primer-Bindungsstellen (siehe Tabelle 3 für eine Liste der qPCR-Primer). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Qualitative Bewertung der Querlenkerumkehr an großen Amplikonen. Die genomische DNA wurde aus vernetzten oder nicht vernetzten Proben hergestellt, sofern angegeben, wie im Protokoll in den Abschnitten 1-5 beschrieben. Nicht-quantitative PCR wurde verwendet, um das 3-kbp-Segment zu amplifizieren, das die Region der Homologie umfasst, die zwischen der Bruchstelle und dem Donor geteilt wird. Beachten Sie, dass es aufgrund der Unterschiede in der Amplifikationseffizienz zwischen vernetzter und nicht vernetzter DNA und der begrenzten Probenmenge nicht möglich war, die Eingangs-DNA zu standardisieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Tabelle 1: S. cerevisiae-Stamm, der für die DLC- und DLE-Assay-Analyse verwendet wird. Genotyp des haploiden knospenden Hefestamms, der in dieser Studie verwendet wurde. Die Sorte ist auf Anfrage erhältlich. Zusätzliche Stämme, die für die DLC/DLE-Assay-Analyse verfügbar sind, finden sich in Piazza et al.8 und Piazza et al.9. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Hybridisierende Oligonukleotide für die DLC- und DLE-Assay-Analyse. Die Sequenzen der langen, hybridisierenden Oligonukleotide, die in den DLC- und DLE-Assays verwendet werden. Eine zusätzliche SDS-PAGE-Reinigung der hybridisierenden Oligonukleotide durch den kundenspezifischen Oligonukleotidanbieter wird empfohlen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: qPCR-Primer für die DLC- und DLE-Assay-Analyse. Die qPCR-Primer-Paare für den DLC und die DLE-Assays und Beschreibungen ihrer Zwecke. Beachten Sie, dass olWDH1764, olWDH2009 und olWDH2010 in zwei qPCRs verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Zusatztabelle S1: Vorlage für DLC-Assay-qPCR-Aufbau und -Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Zusatztabelle S2: Vorlage für DLE-Assay-qPCR-Aufbau und -Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Sequenzdateien 1-5. Ergänzende Sequenzdateien für die relevanten genomischen Merkmale und Amplikone. Die Sequenzdateien liegen im ApE-Dateiformat vor. ApE ist eine frei verfügbare Software zum Betrachten und Bearbeiten von DNA-Sequenzen. ApE-Dateien sind auch mit allen gängigen Sequenzbearbeitungsprogrammen kompatibel. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die vorgestellten Assays ermöglichen den Nachweis von naszierenden und erweiterten D-Schleifen (DLC-Assay), D-Loop-Erweiterung (DLE-Assay) und BIR-Produktbildung (DLE-Assay ohne hybridisierende Oligonukleotide) mittels Proximity-Ligation und qPCR. Die ChIP-qPCR von Rad51 an vom DSB entfernte Stellen wurde zuvor als Proxy für die Rad51-vermittelte Homologiesuche und D-Schleifenbildung verwendet. Dieses ChIP-qPCR-Signal ist jedoch unabhängig von der Sequenzhomologie zwischen der Bruchstelle und einem potenziellen Donor sowie dem Rad51-assoziierten Faktor Rad54 und stellt daher eher eine vorübergehende Assoziation zwischen dem Rad51-ssDNA-Filament und dsDNA dar als ein D-Loop-Zwischenprodukt10,11. Im Gegensatz dazu hängt das DLC-Signal von der DSB-Bildung, Rad51, Rad52, Rad54 und der gemeinsamen Sequenzhomologie zwischen dem DSB und der Spenderstelle ab8. Darüber hinaus werden erhöhte DLC-Signale in Abwesenheit der Mph1- und Srs2-Helikasen und des Sgs1-Top3-Rmi1-Helikasen-Topoisomerase-Komplexes beobachtet, was mit früheren Berichten übereinstimmt, dass diese drei Faktoren Rad51/Rad54-hergestellte entstehende D-Schleifen in vitro 8,25,26,27 zerlegen können. Der DLE-Assay stellt in ähnlicher Weise eine Verbesserung gegenüber früheren Methoden zur Verfolgung der rekombinationsassoziierten DNA-Synthese dar, da er zwischen D-Loop-Erweiterung und BIR-Produktbildung unterscheiden kann19.
Wie oben diskutiert, sind die qPCR-Kontrollen, einschließlich derjenigen für die genomische DNA, die DSB-Induktion, die Psoralenvernetzung, die intramolekulare Ligation und die Oligonukleotidhybridisierung, entscheidend für den Erfolg und die Reproduzierbarkeit dieser Assays. Die rohen genomischen DNA-qPCR-Werte sollten über alle Proben hinweg annähernd gleichwertig sein. Niedrige Cp-Werte für die genomische ARG4-DNA-Kontrolle deuten auf überschüssige DNA hin, und die Anzahl der gesammelten Zellen sollte angepasst werden. Hohe Cp-Werte für diese Kontrolle deuten auf eine unzureichende DNA-Erholung oder Kontamination mit Reagenzien hin, die die qPCR stören. Nach dem Sphäroplastieren kann die Zelllyse mit einem Standardlichtmikroskop und gleichen Mengen an Probe und sterilem Wasser beobachtet werden. Wenn bei Zugabe von Wasser eine unzureichende Lyse beobachtet wird, muss die Zymolyaselösung neu hergestellt oder die Inkubation bei 30 °C verlängert werden. Probe kann auch verloren gehen oder Verunreinigungen während der DNA-Reinigung durch P/C/IA-Extraktion eingebracht werden. Für die effiziente Gewinnung von DNA sollte man sicherstellen, dass der pH-Wert des P/C/IA auf ~8,0 eingestellt wurde und dass die untere Phase beim Entfernen der oberen Phase nicht gestört wird. Schließlich kann eine ineffiziente Resuspension des DNA-Pellets in 1x TE zu niedrigen Cp-Werten führen. Eine längere Inkubation bei 37 °C und Wirbeln verbessern die Resuspension des DNA-Pellets.
Zusätzlich zur genomischen DNA-genomischen DNA-Kontrolle sollten auch die DSB-Induktions- und Restriktionsenzym-Spaltungskontrollreaktionen probenübergreifend ähnlich sein. HO-Endonuklease- oder Restriktionsenzymschneiden an der Stelle der DSB- oder Restriktionsenzymerkennungsstelle verhindert die Amplifikation in dieser Region; Daher liegen typische normalisierte qPCR-Werte für diese Kontrollen nahe Null, und ein hoher qPCR-Wert weist auf eine unzureichende Spaltung hin. Wenn ein hohes Signal an der Stelle des DSB beobachtet wird, sollte die Galaktoselösung neu hergestellt werden. Bei Mutanten mit einem bekannten Zellzyklusdefekt sollte die DSB-Induktion quantifiziert werden, indem gleiche Mengen an Kultur gemäß dem Protokoll (siehe Abschnitt 1) auf YPDA- und YPA-Medien mit Galaktose angebaut werden. Kolonien, die auf galaktosehaltigen Medien wachsen, stellen Hefe dar, bei der durch Endfügung ein unspaltbares HOcs entsteht. Wenn es in einer Mutante von Interesse im Vergleich zum Wildtyp signifikant mehr Endverbindungsereignisse gibt, muss eine Korrektur vorgenommen werden, um diesen Unterschied in der DSB-Induktion auszugleichen, der sich auf das DLC/DLE-Signal auswirkt.
Drei Primerpaare (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 und olWDH2009/olWDH2011) bewerten die Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle durch die hybridisierenden Oligos und das Schneiden durch die Restriktionsenzyme EcoRI-HF und HindIII-HF. Darüber hinaus hängen die intramolekularen Ligationskontrollen auch von einer ausreichenden Restriktionsenzymverdauung ab. Daher hat eine Probe mit geringer intramolekularer Ligationseffizienz und einem hohen Signal für eines dieser drei Primerpaare eine unzureichende Restriktionsenzymschneidung. Ein zusätzliches Restriktionsenzym sollte in nachfolgenden Präparaten bereitgestellt werden, und die Wirksamkeit des Restriktionsenzyms sollte an genomischer DNA bewertet werden. Das primerpaar olWDH1769/olWDH1763 stellt eine zusätzliche Kontrolle für den DLC-Assay dar, der die EcoRI-Spaltung bei DAP2 misst, wo auch die intramolekulare Ligationseffizienz gemessen wird. Eine Probe mit einem adäquaten intramolekularen Ligationssignal, aber einem hohen Signal für eines dieser drei Primerpaare weist eine unzureichende Restriktionsenzymstellenwiederherstellung durch die hybridisierenden Oligos auf. Um dieses Problem anzugehen, sollten Doppelproben entnommen und die Konzentration der betroffenen hybridisierenden Oligo(s) variiert werden. Typische qPCR-Werte, die für diese Reaktionen mit und ohne hybridisierende Oligos erhalten wurden, finden sich in Abbildung 3 und Abbildung 4 sowie in Piazza et al.8 und Piazza et al.9.
Sowohl für den DLC- als auch für den DLE-Assay wird eine intramolekulare Ligationseffizienz von 0,15-0,35, wie sie auf die genomische DNA-Kontrolle normiert ist, als normal angesehen. Da die Detektion von naszierenden und verlängerten D-Schleifen und das BIR-Produkt von einer effizienten Ligation abhängig ist, müssen Proben mit niedrigen Ligationssignalen verworfen werden. Der 10x Ligationspuffer ohne ATP sollte nicht länger als 6 Monate bei 4 °C gelagert werden. Das Sammeln von zu vielen Zellen kann zu einer intermolekularen Ligation führen, was zu einer geringen intramolekularen Ligationseffizienz und einem DLC / DLE-Signal führt.
Obwohl diese Kontrollen für die DLC- und DLE-Assays fast alle empfindlichen Schritte melden, ist es immer noch möglich, nicht-physiologische Werte für das DLC- oder DLE-Signal zu erhalten, wenn diese Kontrollen innerhalb des entsprechenden Bereichs liegen. Ein niedriges DLC- oder DLE-Signal kann durch Fehler im Zellsphäroplasting-Schritt entstehen, der extrem empfindlich ist. Man sollte nur wenige Proben parallel verarbeiten und immer bei 4 °C halten. Ein hohes/niedriges DLC/DLE-Signal kann auch entstehen, wenn zu viele/wenige Zellen zu jedem Zeitpunkt gesammelt werden. Dieses Problem kann gelöst werden, indem zu jedem Zeitpunkt für jede Probe mehrere OD600s Zellen gesammelt werden.
Es gibt mehrere technische und konzeptionelle Einschränkungen für die DLC- und DLE-Assays in ihrer derzeitigen Form. Erstens beträgt die Psoralen-vermittelte Interstrang-Vernetzungsdichte ~1 in 500 bp8. Daher kann ein erhöhtes DLC-Signal entweder anzeigen, dass es mehr D-Schleifen in der Bevölkerung gibt, dass die durchschnittliche Länge der D-Schleifen in der Population zugenommen hat (unter der Annahme, dass D-Schleifen kleiner als 500 bp sein können) oder beides. Darüber hinaus sinkt die Wahrscheinlichkeit, dass eine D-Schleife durch den DLC-Assay erfasst wird, mit abnehmender D-Schleifenlänge. Da sehr kurze D-Schleifen einen signifikanten Teil der gesamten D-Loop-Population in bestimmten mutierten Hintergründen ausmachen können, muss diese Einschränkung des Assays bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. Zweitens erfordert der DLC-Assay DNA-Vernetzung, während der DLE-Assay dies nicht tut. Bisher bedeutete dies für ein bestimmtes Experiment, dass DLC- und DLE-Proben getrennt gesammelt und analysiert werden mussten. Die in Abbildung 5 gezeigte Methode erreicht eine robuste Querverbindungsumkehr, wodurch die Notwendigkeit verringert wird, mehrere Proben aus derselben Kultur zu sammeln. Die Einführung einer zweiten EcoRI-Restriktionsenzymstelle auf dem gebrochenen Strang, stromabwärts der HindIII-Erkennungsstelle, wird eine sequentielle DLC- und DLE-Analyse ermöglichen.
Zusätzlich zu diesen technischen Einschränkungen erlaubt das DLC- und DLE-Assay-System derzeit nicht die Rückgewinnung lebensfähiger HR-Produkte, da die rechte Seite des induzierbaren DSB keine Homologie zum Spender aufweist. Um die Kinetik und den Mechanismus des zweiten Endes und der Synthese besser zu verstehen, könnte das System so modifiziert werden, dass eine Reparatur unter Verwendung einer proximalen oder distalen Region der Homologie, die zwischen dem zweiten Ende des Bruchs und dem Donor geteilt wird, möglich ist (Abbildung 6). Mit Blick auf die Zukunft kann es sich als aufschlussreich erweisen, die DLC- und DLE-Assays mit anderen Technologien wie ChIP-qPCR, Hochdurchsatz-Chromosomenkonformationserfassung (Hi-C) und In-vivo-D-Loop-Mapping zu kombinieren, um eine umfassende Analyse der Kinetik und Regulation der Schritte im HR-Signalweg zu erreichen, einschließlich Bruchbildung, Endresektion, Rad51-Filamentbildung, naszierende D-Loop-Bildung, D-Loop-Erweiterung, D-Loop-Umkehrung, Second-End-Engagement, Second-End-Synthese und Auflösung28.
Zusammenfassend ermöglichen die DLC- und DLE-Assays die Quantifizierung von naszierenden und erweiterten D-Schleifen, D-Loop-Extension und BIR-Produktbildung nach dem Prinzip der Proximity-Ligation. Diese Assays stellen wichtige Fortschritte auf diesem Gebiet dar, da sie die ersten sind, die die semiquantitative Messung der Bildung und Ausdehnung von D-Schleifen unabhängig von der zellulären Lebensfähigkeit ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Arbeiten im Heyer-Labor werden durch die Bewilligungen GM58015 und GM137751 an W.-D.H. Die Forschung im Piazza-Labor wird vom Europäischen Forschungsrat gefördert (ERC-StG 3D-loop, Grand Agreement 851006). D.R. wird von T32CA108459 und der A.P. Giannini Foundation unterstützt. Wir danken Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) für die Weitergabe seiner DLC/DLE-Assay-Ergebnisse und für die zusätzliche Validierung der Änderungen an den Assays, die in diesem Protokoll detailliert beschrieben sind.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
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