用于子宫内膜蜕膜化研究的卵巢切除术小鼠人工蜕膜化模型的生成

Summary

在这里，我们描述了使用卵巢切除小鼠生成人工蜕膜化模型的方法，这是子宫内膜蜕膜化研究领域的经典子宫内膜蜕膜化实验。

Abstract

子宫内膜蜕膜化是子宫内膜独特的分化过程，与月经和怀孕密切相关。蜕膜化障碍导致各种子宫内膜疾病，如不孕、复发性流产和早产。子宫内膜蜕膜化模型在生殖研究中的开发和应用长期以来一直是生殖研究者的一大亮点。鼠标已被广泛用于研究繁殖和蜕膜化。关于蜕膜化，有三种成熟的小鼠模型，即自然妊娠蜕膜化（NPD），人工蜕膜化（AD）和 体外 蜕膜化（IVD）。其中，AD被认为是小鼠蜕膜化的可靠模型，易于实现且接近NPD。本文重点介绍了一种改进的小鼠人工蜕膜化模型的生成和应用方法，以避免卵巢效应，该方法可以获得组内方差小的可重复性结果。该方法为子宫内膜蜕膜化的研究提供了良好可靠的动物模型。

Introduction

随着人类辅助生殖技术的发展，目前体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的临床妊娠率已经达到甚至超过自然妊娠。尽管如此，许多辅助生殖临床实践中的患者仍然接受多次胚胎移植，但未能如愿以偿。但其具体分子机制尚不明确，因此临床干预无效，是^{生殖医学面临的}重大挑战之一1^，2。

子宫内膜因素约占IVF^失败原因的三分之二3。人类胚胎植入分为三个阶段：定位、粘附和侵袭⁴，^5，6。母体子宫内膜经历一系列变化以满足胚胎的到来。形成植入“窗口期”为胚胎植入提供了有利条件^7，8。

在大多数哺乳动物中，囊胚粘附在子宫的管腔上皮后，囊胚周围的基质细胞迅速开始增殖和分化，间充质的快速重塑改变了其形状和功能，导致胚胎着床⁵，^9，10。部位体积和重量的快速增加使囊胚嵌入子宫基质中，这一过程称为蜕膜化¹¹。子宫内膜基质在准备怀孕时分化和重塑，而基质细胞的过渡为蜕膜细胞提供空间和新的信号连接以执行其功能^12，13。基质细胞转化为蜕膜细胞并分泌许多标志性因子，如催乳素（PRL）、胰岛素样生长因子结合蛋白1（Igfbp1）等。研究表明，蜕膜化异常是胚胎着床失败的关键原因之一，但蜕膜化异常的原因尚不清楚，需要进一步阐明1^，14。

小鼠人工蜕膜化模型对于研究蜕膜化的生理过程和分子机制至关重要。人工蜕膜化（AD）主要是指通过人工方法建立的子宫内膜蜕膜化过程，以模拟怀孕或月经周期。在形态方面，妊娠蜕膜化和人工蜕膜化总体差异不大^15，16。子宫腺在蜕膜形成之前存在于子宫内膜中，在蜕膜化后消失。关于基因表达，自然妊娠蜕膜化（NPD）和AD¹⁵之间仅略有差异。因此，小鼠人工蜕膜化模型可以模拟妊娠蜕膜化，探索人类生殖疾病的未知发病机制和新疗法。

NPD，AD和 体外 蜕膜化（IVD）是实现小鼠蜕膜化的三种方法。NPD模型依赖于自然怀孕，最接近母体的生理状态，包括胚胎的影响。比较植入和非植入部位之间的差异是研究蜕膜化的一种更生理、更方便的方法。AD模型是通过使用宫内注射芝麻油作为兴奋剂来诱导假怀孕雌性小鼠与输精管切除的雄性小鼠进行蜕膜化以避免胚胎的影响而开发的。NPD和AD模型在不同的研究目的中起着至关重要的作用，但它们无法避免母体激素代谢的不同活动引起的交配失败和组内差异。IVD是一种依赖于雌激素和孕酮联合在细胞水平上的治疗方法，需要更严格的实验条件和操作能力。然而， 体外 模型不能完全模拟生理条件下的蜕膜反应¹⁵。因此，我们提出了一种从传统AD改进而来的简单而改进的诱导方法，以减少内源性激素对蜕膜化的影响。在保证蜕膜化诱导成功的基础上，更接近生理状态，更适合需要排除胚胎因素的实验。

Protocol

所有描述的动物实验均由南京大学医学院附属鼓楼医院动物使用与护理委员会（第20171202号）批准。所有操作均遵循适当的动物护理和使用机构以及国家准则。 注意：小鼠在特定的无病原体（SPF）环境中饲养，温度为22°C±1°C，相对湿度为50%±1%，光照/黑暗循环为12小时/ 12小时，并且可以自由获取食物和水。 1.小鼠卵巢切除术 手术前1?…

Representative Results

小鼠蜕膜化模型指标包括子宫的一般形态、蜕膜化和非蜕膜化子宫的质量比、子宫内膜的组织学形态、蜕膜化标志物分子的表达水平。油诱导小鼠人工蜕膜子宫的一般形态更接近妊娠期子宫。子宫体变厚，子宫腔比非诱导侧小。诱导子宫角的体积和重量明显高于非诱导侧（图3A，B）。子宫组织HE染色显示，腺体消失，诱导角上的子宫内膜基质细胞分化为大、圆形…

Discussion

小鼠的蜕膜化是一个自发的过程，取决于胚胎的存在，这与人类不同。然而，已经发现人工刺激，如子宫注射玻璃珠和子宫撕裂，可以诱导子宫内膜而不是胚胎的蜕膜化。此外，研究人员发现，许多因素可以诱导蜕膜或参与蜕膜化，例如将类固醇激素，前列腺素和生长抑制因子注射到子宫腔中²¹。与上述建模方法相比，这里详述的卵巢切除术小鼠模型，使用芝麻油作为兴奋剂，?…

Materials

Estrogen	Sigma	E2758	Hormone supplement
Progesterone	Sigma	P0130	Hormone supplement
Sesame oil	Sigma	S3547	Hormone supplement
Sodium pentobarbital	Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.		Anaesthesia
Meloxicam injection	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Analgesia
Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method)	Solarbio	G1480	Alkaline phophatase stain
Eosin	Servicebio	G1005-2	HE stain
Hematoxylin	Servicebio	G1005-1	HE stain
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% ethanol	Lircon	ZH1120090	Disinfect
Iodophor	Runzekang	RZK-DF	Disinfect
Erythromycin Eye Ointment	Guangzhou Baiyunshan		Mice eyeball protect
4-0 suture	Ethicon	W329	Incision suture
10% formalin	Yulu	L25010118	Tissue fix
Optimal cutting temperature compound	Sakura	4583	Ssection
Trizol reagent	Ambion	15596018	qPCR