Generatie van een muis kunstmatig decidualisatiemodel met ovariëctomie voor endometriumdecidualisatieonderzoek

Summary

Hier beschrijven we de methode voor het genereren van een kunstmatig decidualisatiemodel met behulp van de ovariëctomische muis, een klassiek endometriumdecidualisatie-experiment op het onderzoeksgebied van endometriumdecidualisatie.

Abstract

Endometriumdecidualisatie is een uniek differentiatieproces van het endometrium, nauw verwant aan menstruatie en zwangerschap. Aantasting van decidualisatie leidt tot verschillende endometriumstoornissen, zoals onvruchtbaarheid, terugkerende miskraam en vroeggeboorte. De ontwikkeling en het gebruik van het endometriumdecidualisatiemodel in reproductieve studies zijn al lange tijd een hoogtepunt voor reproductieve onderzoekers. De muis is uitgebreid gebruikt bij het bestuderen van voortplanting en decidualisatie. Er zijn drie gevestigde muismodellen met betrekking tot decidualisatie, namelijk natuurlijke zwangerschapsdecidualisatie (NPD), kunstmatige decidualisatie (AD) en in vitro decidualisatie (IVD). Onder hen wordt AD beschouwd als een betrouwbaar model voor muisdecidualisatie, dat gemakkelijk te implementeren is en dicht bij NPD ligt. Dit artikel richt zich op een aangepaste methode van het generatie- en toepassingsproces van het kunstmatige decidualisatiemodel van de muis met ovariëctomie om ovariële effecten te voorkomen, die zeer reproduceerbare resultaten kunnen verkrijgen met kleine variaties binnen de groep. Deze methode biedt een goed en betrouwbaar diermodel voor de studie van endometriumdecidualisatie.

Introduction

Met de ontwikkeling van door de mens geassisteerde voortplantingstechnologie heeft het huidige klinische zwangerschapspercentage van in-vitrofertilisatie-embryotransfer (IVF-ET) dat van natuurlijke zwangerschap bereikt of zelfs overtroffen. Desondanks ondergaan veel patiënten in de klinische praktijk voor geassisteerde voortplanting nog steeds meerdere embryotransfers, maar slagen er niet in om de zwangerschap naar wens te bereiken. Het specifieke moleculaire mechanisme is echter nog steeds onduidelijk, dus klinische interventie is niet effectief, wat een van de belangrijke uitdagingen is voor reproductieve geneeskunde ^1,2.

Endometriumfactoren zijn verantwoordelijk voor ongeveer tweederde van de oorzaken van IVF-falen³. Implantatie van menselijk embryo is verdeeld in drie fasen: positionering, adhesie en invasie ^4,5,6. Het maternale endometrium ondergaat een reeks veranderingen om tegemoet te komen aan de komst van het embryo. Het vormen van een implantatie “vensterperiode” biedt gunstige omstandigheden voor embryo-implantatie ^7,8.

Bij de meeste zoogdieren, nadat de blastocyst zich hecht aan het luminale epitheel van de baarmoeder, beginnen de stromale cellen rond de blastocyst zich snel te vermenigvuldigen en te differentiëren, en de snelle remodellering van het mesenchym verandert van vorm en functie, wat leidt tot embryo-implantatie ^5,9,10. De snelle toename van het volume en gewicht van de plaats zorgt ervoor dat de blastocyst wordt ingebed in het baarmoederstroma, een proces dat bekend staat als decidualisatie¹¹. Het endometriumstroma differentieert en remodelleert ter voorbereiding op de zwangerschap, terwijl de overgang van stromale cellen ruimte en nieuwe signaalverbindingen biedt voor deciduale cellen om hun functies uit te voeren^12,13. Stromale cellen transformeren in deciduale cellen en scheiden veel iconische factoren af, zoals prolactine (PRL), insuline-achtig groeifactorbindend eiwit 1 (Igfbp1), enzovoort. Studies hebben aangetoond dat abnormale decidualisatie een van de belangrijkste redenen is voor het falen van embryo-implantatie, maar de oorzaak van abnormale decidualisatie is nog steeds onduidelijk en moet verder worden opgehelderd ^1,14.

Het kunstmatige decidualisatiemodel van de muis is essentieel voor het bestuderen van het fysiologische proces en de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan decidualisatie. Kunstmatige decidualisatie (AD) verwijst voornamelijk naar het proces van endometriumdecidualisatie dat is vastgesteld door kunstmatige methoden om zwangerschap of de menstruatiecyclus te simuleren. In termen van morfologie is er weinig algemeen verschil tussen zwangerschapsdecidualisatie en kunstmatige decidualisatie^15,16. De baarmoederklieren bestaan in het baarmoederslijmvlies voordat decidua zich vormen en verdwijnen na decidualisatie. Wat de genexpressie betreft, wordt slechts een klein verschil vastgesteld tussen natuurlijke zwangerschapsdecidualisatie (NPD) en AD¹⁵. Bijgevolg kan het kunstmatige decidualisatiemodel bij muizen zwangerschapsdecidualisatie simuleren om de onbekende pathogenese en nieuwe behandeling van menselijke reproductieve ziekten te verkennen.

NPD, AD en in vitro decidualisatie (IVD) zijn drie methoden om muisdecidualisatie te bereiken. Het NPD-model is afhankelijk van natuurlijke zwangerschap en ligt het dichtst bij de fysiologische toestand van de moeder, inclusief de effecten van embryo’s. Het vergelijken van de verschillen tussen implantatie- en niet-implantatieplaatsen is een meer fysiologische en handige benadering voor het bestuderen van decidualisatie. Het AD-model werd ontwikkeld door een intra-uteriene injectie van sesamolie te gebruiken als een stimulerend middel om decidualisatie te induceren in een pseudopregnant vrouwelijke muis gepaard met vasectomie mannetjes om de impact van embryo’s te voorkomen. Zowel NPD- als AD-modellen spelen een essentiële rol in verschillende onderzoeksdoeleinden, maar ze kunnen paringsfalen en verschillen binnen de groep niet voorkomen die worden veroorzaakt door de verschillende activiteiten van het maternale hormoonmetabolisme. IVD is een methode die afhankelijk is van de behandeling van gecombineerd oestrogeen en progesteron op cellulair niveau, waarvoor strengere experimentele omstandigheden en operationele capaciteit vereist zijn. Het in vitro model kan de decidual respons echter niet volledig simuleren onder fysiologische omstandigheden¹⁵. Daarom stellen we een eenvoudige en verbeterde inductiemethode voor die is aangepast van traditionele AD om het effect van endogene hormonen op decidualisatie te verminderen. Gebaseerd op het verzekeren van het succes van decidualisatie-inductie, is het dichter bij de fysiologische toestand en meer geschikt voor experimenten die embryofactoren moeten uitsluiten.

Protocol

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Affiliated Drum Tower Hospital van het Nanjing University Medical School’s Committee on the Use and Care of Animals (nr. 20171202). Alle operaties volgen de juiste dierverzorgings- en gebruiksinstantie en nationale richtlijnen. OPMERKING: Muizen werden grootgebracht in een specifieke pathogeenvrije (SPF) omgeving, met een temperatuur van 22 °C ± 1 °C, een relatieve vochtigheid van 50% ± 1%, een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur en …

Representative Results

De muis decidualisatie model indexen omvatten de algemene morfologie van de baarmoeder, de massaverhouding van de gedecidualiseerde en niet-gedecidualiseerde baarmoeder, de histologische morfologie van het endometrium en het expressieniveau van decidualisatie marker moleculen. De algemene morfologie van de kunstmatige gedecidualiseerde baarmoeder van muizen geïnduceerd door olie ligt dichter bij die van de baarmoeder tijdens de zwangerschap. Het baarmoederlichaam wordt dik en de baarmoederholte wordt kleiner dan de niet…

Discussion

Decidualisatie bij muizen is een spontaan proces afhankelijk van de aanwezigheid van embryo’s, wat verschilt van mensen. Het is echter gebleken dat kunstmatige stimulatie zoals baarmoederinjectie van glasparels en baarmoederscheuring decidualisatie van het baarmoederslijmvlies kan veroorzaken in plaats van embryo’s. Bovendien ontdekten onderzoekers dat veel factoren decidual kunnen induceren of deelnemen aan decidualisatie, zoals de injectie van steroïde hormonen, prostaglandinen en groeiremmende factoren in de baarmoed…

Materials

Estrogen	Sigma	E2758	Hormone supplement
Progesterone	Sigma	P0130	Hormone supplement
Sesame oil	Sigma	S3547	Hormone supplement
Sodium pentobarbital	Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.		Anaesthesia
Meloxicam injection	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Analgesia
Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method)	Solarbio	G1480	Alkaline phophatase stain
Eosin	Servicebio	G1005-2	HE stain
Hematoxylin	Servicebio	G1005-1	HE stain
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% ethanol	Lircon	ZH1120090	Disinfect
Iodophor	Runzekang	RZK-DF	Disinfect
Erythromycin Eye Ointment	Guangzhou Baiyunshan		Mice eyeball protect
4-0 suture	Ethicon	W329	Incision suture
10% formalin	Yulu	L25010118	Tissue fix
Optimal cutting temperature compound	Sakura	4583	Ssection
Trizol reagent	Ambion	15596018	qPCR