Ein auf Durchflusszytometrie basierender Zelloberflächenproteinbindungsassay zur Beurteilung der Selektivität und Spezifität eines Antikrebs-Aptamers

Summary

Ein notwendiger Schritt in der Entwicklung von Antikrebs-Aptamern besteht darin, seine Bindung an das Ziel zu testen. Wir demonstrieren einen durchflusszytometrischen Assay zur Untersuchung dieser Bindung und betonen die Bedeutung der Einbeziehung eines Negativkontrollaptamers und Krebszellen, die für dieses bestimmte Protein positiv oder negativ sind.

Abstract

Eine zentrale Herausforderung bei der Entwicklung eines Antikrebs-Aptamers besteht darin, die Selektivität und Spezifität des entwickelten Aptamers für das Zielprotein effizient zu bestimmen. Aufgrund seiner zahlreichen Vorteile gegenüber monoklonalen Antikörpern hat die Aptamer-Entwicklung unter Krebsforschern enorme Popularität erlangt. Die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) ist die gebräuchlichste Methode zur Entwicklung von Aptameren, die spezifisch für Proteine von Interesse sind. Nach SELEX beschleunigt ein schneller und effizienter Bindungsassay den Identifizierungsprozess und bestätigt die Selektivität und Spezifität des Aptamers.

Dieser Artikel erläutert einen schrittweisen durchflusszytometrischen Bindungsassay eines Aptamers, das spezifisch für epitheliale zelluläre Adhäsionsmoleküle (EpCAM) ist. Das Transmembran-Glykoprotein EpCAM wird in den meisten Karzinomen überexprimiert und spielt eine Rolle bei der Initiierung, Progression und Metastasierung von Krebs. Daher ist es ein wertvoller Kandidat für die gezielte Medikamentenabgabe an Tumore. Um die Selektivität und Spezifität des Aptamers gegenüber der membrangebundenen EpCAM zu bewerten, werden EpCAM-positive und -negative Zellen benötigt. Zusätzlich wird ein unverbindlicher EpCAM-Aptamer mit ähnlicher Länge und 2-dimensionaler (2D) Struktur wie der EpCAM-bindende Aptamer benötigt. Der Bindungsassay umfasst verschiedene Puffer (Blockierungspuffer, Waschpuffer, Inkubationspuffer und FACS-Puffer) und Inkubationsschritte.

Das Aptamer wird mit den Zelllinien inkubiert. Nach den Inkubations- und Waschschritten werden die Zellen mit einem empfindlichen Durchflusszytometrie-Assay bewertet. Die Analyse der Ergebnisse zeigt die Bindung des EpCAM-spezifischen Aptamers an EpCAM-positive Zellen und nicht an die EpCAM-negativen Zellen. In EpCAM-positiven Zellen wird dies als Bandverschiebung in der Bindung des EpCAM-Aptamers nach rechts im Vergleich zur unverbindlichen Aptamerkontrolle dargestellt. In EpCAM-negativen Zellen überlappen sich die entsprechenden Banden von EpCAM-bindenden und -nicht-bindenden Aptameren. Dies zeigt die Selektivität und Spezifität des EpCAM-Aptamers. Während sich dieses Protokoll auf den EpCAM-Aptamer konzentriert, ist das Protokoll auf andere veröffentlichte Aptamere anwendbar.

Introduction

Krebs ist nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen weltweit¹. Trotz der deutlichen Verbesserung der Krebsbehandlung in den letzten Jahrzehnten ist die Entwicklung von Krebsmedikamenten immer noch ein viel diskutiertes Thema. Dies liegt daran, dass die Chemotherapie als Hauptstütze der Krebsbehandlung von schwerwiegenden Nebenwirkungen begleitet wird, die die Einhaltung der Behandlung durch den Patienten einschränken. Darüber hinaus hat die durch Chemotherapie induzierte Krebsresistenz ihre Anwendung als einzige Wahl der medizinischen Intervention eingeschränkt. Die Anwendung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) führte zu einem verbesserten Ansprechen auf^{Krebsbehandlungen 2}. Der Grund für die Verwendung von mAbs bestand darin, die Wirksamkeit von Chemotherapeutika zu verbessern und ihre Nebenwirkungen zu minimieren. Die Verabreichung von mAbs wurde jedoch auch zu einer Herausforderung. Dies lag nicht nur an den mAb-induzierten immunologischen Reaktionen, sondern auch an den tierabhängigen und teuren Produktionskosten und schwierigen Lagerbedingungen³. Die Einführung von Aptameren in den 1990er Jahren⁴ weckte neue Hoffnungen in der Krebsbehandlung, da die Anwendung von Aptameren die mit mAbs verbundenen Herausforderungen angehen könnte.

Aptamere sind kurze Nukleinsäuresequenzen, die spezifisch für ein bestimmtes Ziel hergestellt werden. Die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) ist eine gängige Methode in der Aptamerproduktion. In SELEX wird das interessierende Protein mit einer Bibliothek zufälliger Nukleotidsequenzen inkubiert, und durch eine Reihe von iterativen Zyklen wird das für dieses Protein spezifische Aptamer gereinigt. Aptamere haben eine ähnliche Zielselektivität und Spezifität wie mAbs, und daher zeigt die Medikamentenentwicklung in diesem Bereich vielversprechende zukünftige Anwendungen. Aptamere spezifisch für Krebsbiomarker könnten als Einzelmedikamente und Krebsdiagnosewerkzeuge eingesetzt werden ^5,6,7. Aufgrund ihrer nanoskaligen Struktur könnten diese Aptamere auch als Wirkstoffträger fungieren, um zytotoxische Wirkstoffe spezifisch an den Tumor abzugeben⁸. Dies würde die Wirksamkeit der gezielten Medikamentenabgabe erhöhen und chemotherapieassoziierte, Off-Target-Nebenwirkungen verringern. Darüber hinaus haben diese Nanomedikamente eine hohe Gewebepenetration, was sie zu einem wünschenswerten Kandidaten für die Verabreichung und Behandlung von Medikamenten in tiefen Tumoren macht. Aptamere können auch so konzipiert werden, dass sie auf die Transporter abzielen, die auf der Blut-Hirn-Schranke (BBB) exprimiert werden, um die Medikamentenabgabe an Hirntumoren zu verbessern⁹. Ein gutes Beispiel für ein solches Aptamer sind bifunktionelle Aptamere, die auf den Transferrinrezeptor (TfR)¹⁰ abzielen, um die Wirkstoffabgabe über die BHS zu verbessern, und eine zytotoxische Wirkstoffnutzlast an Tumorzellen abgeben¹¹.

Trotz aller Vorteile von Aptameren hat die Medikamentenentwicklung auf diesem Gebiet noch kein vermarktetes, erfolgreiches Krebsmedikament hervorgebracht. Ein Grund dafür könnte das Fehlen standardisierter und reproduzierbarer Methoden sein, denen Forscher weltweit folgen könnten. In dieser Arbeit wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll eines Aptamers demonstriert, das an ein natives Protein bindet, das auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Dieses Protokoll ist ein Voraussetzung für die präklinische Bewertung von Antikrebs-Aptameren. Der Assay wird durchgeführt, um die Selektivität und Spezifität des gereinigten Aptamers aus SELEX oder einer veröffentlichten Aptamersequenz zur Bestätigung der Selektivität und Spezifität nachzuweisen. Dieser durchflusszytometrische Assay ist ein schneller, zuverlässiger und empfindlicher Assay, der die Selektivität und Spezifität des Aptamers genau zeigt, wobei das Aptamer gegen Proteine auf der Zelloberfläche^{getestet wird 12,13,14}. Diese Methode wird anhand der Bindung eines für EpCAM spezifischen Aptamers demonstriert, das in diesem Paper¹⁵ gezeigt wird. EpCAM spielt als Transmembran-Glykoprotein eine Rolle bei der Signalisierung, Progression, Migration und Metastasierung von Tumorzellen^16,17. Um die Selektivität und Spezifität dieses Aptamers zu zeigen, wurden EpCAM-positive und -negative Krebszellen verwendet. Das zuvor entwickelte EpCAM-spezifische Aptamer TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) und ein Negativkontrollaptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), wurden als EpCAM-bindende bzw. -unverbindliche Aptamere verwendet,¹⁰. Das 3′-Ende von TEPP und TENN wurde mit einem TYE665-Fluorophor markiert.

TEPP ist ein bifunktionaler Aptamer, der von einem Ende auf EpCAM und auf der anderen Seite auf TfR abzielt. Dies hat TEPP zu einem geeigneten Kandidaten für die Medikamentenabgabe bei EpCAM⁺ -Hirntumoren gemacht. Mit seinem TfR-spezifischen Ende durchquert TEPP die Blut-Hirn-Schranke und findet mit dem EpCAM-spezifischen Ende den Tumor und liefert seine Fracht (z. B. zytotoxische Medikamente) an den Tumor. TENN hat eine ähnliche Länge und 2D-Struktur wie TEPP, hat aber keine Affinität zur EpCAM oder TfR und ist daher ein geeigneter Negativkontrollaptamer. Unter Verwendung von TEPP und TENN wird in diesem Artikel gezeigt, wie die Bindung eines Aptamers an das Zielprotein mittels Durchflusszytometrie getestet wird. Dieses Protokoll gilt für die Entwicklung zellspezifischer Aptamere. Sie ist auch auf weitere Komplementär- und Bestätigungsanalysen der in der Literatur verfügbaren Aptamersequenzen anwendbar. Das Protokoll kann auch von Aptamer-Neulingen verwendet werden, die ein zuvor veröffentlichtes Aptamer für ihre Forschungs- und Entwicklungszwecke (F & E) verwenden möchten. In dieser Arbeit werden zwei in der Literatur verfügbare Aptamersequenzen untersucht.

Protocol

HINWEIS: Tragen Sie vor Beginn des Experiments persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille. Weitere Informationen zu Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle . 1. Für den Assay erforderliche Puffer Bereiten Sie die für dieses Experiment erforderlichen Puffer – den für die Aptamerfaltung erforderlichen SELEX-Puffer, den Bl…

Representative Results

Ein wichtiger Aspekt der Entdeckung und Entwicklung neuer Wirkstoffe ist die Sicherstellung der Selektivität und Spezifität des Wirkstoffkandidaten. Dies bedeutet, dass der Wirkstoffkandidat in der Lage sein sollte, zwischen verschiedenen Zellen zu unterscheiden und nur die interessierende Zellpopulation zu beeinflussen (Selektivität). Die Selektivität wird anhand von Zelllinien untersucht, die sich in der Expression des interessierenden Proteins unterscheiden. In dieser Studie wurden MDA-MB-231 und HEK 293T Zelllini…

Discussion

Die größte Herausforderung bei der Entwicklung neuer Aptamere ist das Fehlen von Standardrichtlinien, die für verschiedene Schritte dieses Prozesses gelten. McKeague et al. haben kürzlich einige der damit verbundenen Herausforderungen aufgezeigt, die zu unklaren Darstellungen von Daten in Publikationen und zum Versagen führen, die Forschung zu replizieren. Sie schlugen grundlegende Richtlinien vor, die für die Berücksichtigung bei der Charakterisierung von Aptameren erforderlich sind¹⁹. Ein…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid	Sigma-Aldrich	T6649
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube	Greiner Bio One	188271
5 mL serological pipettes	Greiner Bio One	606180
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer	Becton Dickinson	N/A
BD FACSDiva V9.0	BD Biosciences	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder	Sigma-AldrichTM	A7906-50G
Bright-line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder	Life Technologies	12100046
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21300025
FlowJo, LLC 10.8.1	BD Biosciences	N/A
Foetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	SFBS-F
HEK293T	American Type Culture Collection	ACS-4500
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	N/A
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	N/A
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
MDA-MB-231	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black	Greiner Bio One	655076
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets	Life Technologies	18912014
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water	Milli-Q
T75 Cell Culture flask	Cellstar	658170
TENN	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPP	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)	Sigma-Aldrich	R8508-5X1ML
Trypan Blue Solution	Life Technologies	15250061
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054