Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi
Summary
Antikanser aptamer gelişiminde gerekli bir adım, hedefe bağlanmasını test etmektir. Bu bağlanmayı incelemek için akış sitometrik tabanlı bir tahlil gösteriyoruz ve negatif bir kontrol aptamer ve bu belirli protein için pozitif veya negatif olan kanser hücrelerinin dahil edilmesinin önemini vurguluyoruz.
Abstract
Bir antikanser aptamer geliştirmede önemli bir zorluk, geliştirilen aptamerin hedef proteine seçiciliğini ve özgüllüğünü etkili bir şekilde belirlemektir. Monoklonal antikorlara göre çeşitli avantajları nedeniyle, aptamer gelişimi kanser araştırmacıları arasında muazzam bir popülerlik kazanmıştır. Ligandların üstel zenginleştirme (SELEX) ile sistematik evrimi, ilgilenilen proteinlere özgü aptamerler geliştirmenin en yaygın yöntemidir. SELEX’i takiben, hızlı ve etkili bir bağlama testi, aptamerin seçiciliğini ve özgüllüğünü doğrulayarak tanımlama sürecini hızlandırır.
Bu yazıda, epitelyal hücresel adezyon molekülü (EpCAM) için spesifik bir aptamerin adım adım akış sitometrik tabanlı bağlanma testi açıklanmaktadır. Transmembran glikoprotein EpCAM çoğu karsinomda aşırı eksprese edilir ve kanser başlangıcı, progresyonu ve metastazda rol oynar. Bu nedenle, tümörlere hedefe yönelik ilaç dağıtımı için değerli bir adaydır. Aptamerin membrana bağlı EpCAM’e seçiciliğini ve özgüllüğünü değerlendirmek için, EpCAM-pozitif ve -negatif hücreler gereklidir. Ek olarak, EpCAM bağlayıcı aptamer’e benzer uzunlukta ve 2 boyutlu (2D) yapıya sahip bağlayıcı olmayan bir EpCAM aptamer gereklidir. Bağlama tahlili farklı tamponlar (blokaj tamponu, yıkama tamponu, inkübasyon tamponu ve FACS tamponu) ve inkübasyon adımlarını içerir.
Aptamer, hücre hatları ile inkübe edilir. Kuluçka ve yıkama adımlarını takiben, hücreler hassas bir akış sitometri testi kullanılarak değerlendirilecektir. Sonuçların analizi, EpCAM’e özgü aptamerin EpCAM-negatif hücrelere değil, EpCAM-pozitif hücrelere bağlandığını göstermektedir. EpCAM-pozitif hücrelerde bu, bağlanmayan aptamer kontrolüne kıyasla EpCAM aptamer’in sağa bağlanmasında bir bant kayması olarak tasvir edilir. EpCAM-negatif hücrelerde, karşılık gelen EpCAM bağlayıcı ve -bağlanmayan aptamer bantları üst üste biner. Bu, EpCAM aptamerinin seçiciliğini ve özgüllüğünü gösterir. Bu protokol EpCAM aptamerine odaklanırken, protokol yayınlanan diğer aptamerler için geçerlidir.
Introduction
Kanser hala dünya çapında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir1. Son yıllarda kanser tedavisindeki önemli iyileşmeye rağmen, antikanser ilaç geliştirme hala çok tartışılan bir konudur. Bunun nedeni, kanser tedavisinin temel dayanağı olan kemoterapiye, hastanın tedaviye uyumunu sınırlayan ciddi yan etkilerin eşlik etmesidir. Ayrıca, kemoterapiye bağlı kanserin tedaviye direnci, tıbbi müdahalenin tek tercihi olarak uygulanmasını kısıtlamıştır. Monoklonal antikorların (mAbs) uygulanması, kanser tedavilerine gelişmiş bir yanıtgetirmiştir 2. mAbs kullanmanın mantığı, kemoterapötiklerin etkinliğini artırmak ve advers reaksiyonlarını en aza indirmekti. Bununla birlikte, mAbs’lerin yönetimi de bir zorluk haline geldi. Bu sadece mAb kaynaklı immünolojik reaksiyonlardan değil, aynı zamanda hayvana bağımlı ve pahalı üretim maliyetlerinden ve zorlu depolama koşullarından da kaynaklanıyordu3. 1990’larda aptamerlerin tanıtılması4 , kanser tedavisinde yeni umutlar yarattı, çünkü aptamerlerin uygulanması mAbs ile ilgili zorlukları ele alabilir.
Aptamerler, belirli bir hedef için özel olarak üretilen kısa nükleik asit dizileridir. Ligandların üstel zenginleştirme (SELEX) ile sistematik evrimi, aptamer üretiminde yaygın bir yöntemdir. SELEX’te, ilgilenilen protein, rastgele nükleotid dizilerinden oluşan bir kütüphane ile inkübe edilir ve bir dizi yinelemeli döngü yoluyla, bu protein için spesifik aptamer saflaştırılır. Aptamerler, mAb’lere benzer hedef seçiciliğe ve özgüllüğe sahiptir ve bu nedenle bu alandaki ilaç geliştirme, gelecekteki umut verici uygulamaları göstermektedir. Kanser biyobelirteçlerine özgü aptamerler tek ilaç ve kanser tanı araçları olarak uygulanabilir 5,6,7. Nano boyutlu yapıları nedeniyle, bu aptamerler ayrıca sitotoksik ajanları özellikle tümöre vermek için ilaç taşıyıcıları olarak da işlev görebilir8. Bu, hedeflenen ilaç dağıtımının etkinliğini artıracak ve kemoterapi ile ilişkili, hedef dışı advers reaksiyonları azaltacaktır. Dahası, bu nanoilaçlar yüksek doku penetrasyonuna sahiptir, bu da onları derin tümör ilaç dağıtımı ve tedavisi için arzu edilen bir aday haline getirir. Aptamerler ayrıca beyin tümörlerine ilaç dağıtımını iyileştirmek için kan-beyin bariyerinde (BBB) ifade edilen taşıyıcıları hedeflemek üzere tasarlanabilir9. Böyle bir aptamerin iyi bir örneği, BBB boyunca ilaç dağıtımını arttırmak için transferrin reseptörünü (TfR)10 hedefleyen ve tümör hücrelerine sitotoksik bir ilaç yükü veren iki işlevli aptamerlerdir11.
Aptamers’ın tüm avantajlarına rağmen, bu alandaki ilaç geliştirme henüz pazarlanmış, başarılı bir antikanser ilacı vermemiştir. Bunun bir nedeni, alandaki araştırmacılar tarafından küresel olarak takip edilebilecek standart ve tekrarlanabilir yöntemlerin eksikliği olabilir. Bu yazıda, hücre yüzeyinde eksprese edilen doğal bir proteine bağlanan bir aptamerin adım adım protokolü gösterilmiştir. Bu protokol, antikanser aptamerlerinin klinik öncesi değerlendirmesinde ön koşul adımıdır. Tahlil, seçicilik ve özgüllüğün doğrulanması için SELEX’ten toplanan saflaştırılmış aptamerin veya yayınlanmış bir aptamer dizisinin seçiciliğini ve özgüllüğünü göstermek için yapılır. Bu akış sitometrik tabanlı tahlil, aptamerin hücre yüzeyindeki proteinlere karşı test edildiği aptamerin seçiciliğini ve özgüllüğünü doğru bir şekilde gösteren hızlı, güvenilir, hassas bir tahlildir12,13,14. Bu yöntem, bu makalede gösterilen EpCAM için spesifik bir aptamerin bağlanması kullanılarak gösterilmiştir15. EpCAM, bir transmembran glikoprotein olarak, tümör hücresi sinyalizasyonu, progresyonu, migrasyon ve metastazda rol oynar16,17. Bu aptamerin seçiciliğini ve özgüllüğünü göstermek için EpCAM-pozitif ve -negatif kanser hücreleri kullanıldı. Daha önce geliştirilen EpCAM’e özgü aptamer, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) ve negatif kontrol aptameri TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), sırasıyla10 EpCAM bağlayıcı ve -bağlayıcı olmayan aptamers olarak kullanılmıştır. Hem TEPP hem de TERN’in 3′ ucu bir TYE665 florofor ile etiketlendi.
TEPP, bir uçtan EpCAM’i ve diğer uçtan TfR’yi hedefleyen iki işlevli bir aptamerdir. Bu, TEPP’yi EpCAM + beyin tümörlerine ilaç dağıtımı için uygun bir aday haline getirmiştir. TEPP, TfR’ye özgü ucunu kullanarak kan-beyin bariyerini geçer ve EpCAM’e özgü ucu kullanarak tümörü bulur ve kargosunu (örneğin, sitotoksik ilaçlar) tümöre iletir. TERN, TEPP ile benzer bir uzunluğa ve 2D yapıya sahiptir, ancak EpCAM veya TfR için afiniteye sahip değildir ve bu nedenle uygun bir negatif kontrol aptameridir. TEPP ve TENN kullanılarak, bir aptamerin hedef proteine bağlanmasının akış sitometrisi kullanılarak test edilmesi bu makalede gösterilmiştir. Bu protokol, hücreye özgü aptamerlerin gelişimi için geçerlidir. Ayrıca literatürde mevcut olan aptamer dizilerinin tamamlayıcı ve doğrulama analizleri için de geçerlidir. Protokol, daha önce yayınlanmış bir aptamer’ı araştırma ve geliştirme (Ar-Ge) amaçları için kullanmayı düşünen aptamer alanında yeni olanlar tarafından da kullanılabilir. Bu yazıda literatürde mevcut olan iki aptamer dizisi incelenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yeni aptamers geliştirmenin temel zorluğu, bu sürecin farklı adımlarına uygulanan standart kılavuzların eksikliğidir. McKeague ve ark. son zamanlarda, yayınlardaki verilerin belirsiz sunumlarına ve araştırmanın çoğaltılamamasına yol açan bazı ilgili zorlukları göstermiştir. Aptamerlerin19’unu karakterize etmede dikkate alınması gereken temel kılavuzları önerdiler. Bir aptamer bağlama testi, alandaki araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan aptamers<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Zihinsel ve Fiziksel Sağlık ve Klinik Çeviri Enstitüsü (IMPACT) SEED finansmanını, Deakin Üniversitesi’ndeki “Alfred Deakin Doktora Sonrası Araştırma Bursu” programını ve “Avustralya Hükümeti Araştırma Eğitim Programı Bursu” nu kabul etmektedir.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
References
- Cancer. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022)
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development – Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al. Advances in aptamer-based biomarker discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. . Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D’huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -. X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
