Een flowcytometrie-gebaseerde celoppervlakeiwitbindingstest voor het beoordelen van selectiviteit en specificiteit van een antikanker aptamer

Summary

Een noodzakelijke stap in de ontwikkeling van aptameren tegen kanker is om de binding aan het doelwit te testen. We demonstreren een flowcytometrische test om deze binding te bestuderen, waarbij we het belang benadrukken van het opnemen van een negatieve controle aptamer en kankercellen die positief of negatief zijn voor dat specifieke eiwit.

Abstract

Een belangrijke uitdaging bij het ontwikkelen van een antikanker aptamer is om efficiënt de selectiviteit en specificiteit van het ontwikkelde aptamer voor het doeleiwit te bepalen. Vanwege de verschillende voordelen ten opzichte van monoklonale antilichamen, heeft de ontwikkeling van aptameren een enorme populariteit gewonnen onder kankeronderzoekers. Systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) is de meest gebruikelijke methode voor het ontwikkelen van aptameren die specifiek zijn voor eiwitten van belang. Na SELEX versnelt een snelle en efficiënte bindingstest het identificatieproces en bevestigt de selectiviteit en specificiteit van het aptamer.

Dit artikel verklaart een stap-voor-stap flow cytometrische bindingstest van een aptamer specifiek voor epitheliale cellulaire adhesie molecuul (EpCAM). Het transmembraanglycoproteïne EpCAM is overexpressie in de meeste carcinomen en speelt een rol bij het initiëren van kanker, progressie en metastase. Daarom is het een waardevolle kandidaat voor gerichte medicijnafgifte aan tumoren. Om de selectiviteit en specificiteit van de aptamer voor de membraangebonden EpCAM te evalueren, zijn EpCAM-positieve en -negatieve cellen vereist. Daarnaast is een niet-bindende EpCAM-aptamer met een vergelijkbare lengte en 2-dimensionale (2D) structuur als de EpCAM-bindende aptamer vereist. De bindingstest omvat verschillende buffers (blokkeringsbuffer, wasbuffer, incubatiebuffer en FACS-buffer) en incubatiestappen.

Het aptamer wordt geïncubeerd met de cellijnen. Na de incubatie- en wasstappen worden de cellen geëvalueerd met behulp van een gevoelige flowcytometrietest. Analyse van de resultaten toont de binding van de EpCAM-specifieke aptamer aan EpCAM-positieve cellen en niet de EpCAM-negatieve cellen. In EpCAM-positieve cellen wordt dit weergegeven als een bandverschuiving in de binding van de EpCAM-aptamer naar rechts in vergelijking met de niet-bindende aptamercontrole. In EpCAM-negatieve cellen overlappen de overeenkomstige banden van EpCAM-bindende en -niet-bindende aptameren elkaar. Dit toont de selectiviteit en specificiteit van de EpCAM aptamer. Hoewel dit protocol gericht is op de EpCAM aptamer, is het protocol van toepassing op andere gepubliceerde aptameren.

Introduction

Kanker is wereldwijd nog steeds een van de belangrijkste doodsoorzaken¹. Ondanks de aanzienlijke verbetering van de behandeling van kanker in de afgelopen decennia, is de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen kanker nog steeds een veelbesproken onderwerp. Dit komt omdat chemotherapie, als de steunpilaar van de behandeling van kanker, gepaard gaat met ernstige bijwerkingen die de therapietrouw van de patiënt beperken. Bovendien heeft chemotherapie-geïnduceerde kankerresistentie tegen behandeling de toepassing ervan beperkt als de enige keuze voor medische interventie. De toepassing van monoklonale antilichamen (mAbs) introduceerde een verbeterde respons op kankerbehandelingen². De reden voor het gebruik van mAbs was om de werkzaamheid van chemotherapeutica te verbeteren en hun bijwerkingen te minimaliseren. Het beheer van mAbs werd echter ook een uitdaging. Dit kwam niet alleen door de door mAb geïnduceerde immunologische reacties, maar ook door de dierafhankelijke en dure productiekosten en moeilijke bewaarcondities³. Introductie van aptameren in de jaren 1990⁴ wekte nieuwe hoop in de behandeling van kanker, omdat de toepassing van aptameren de uitdagingen in verband met mAbs zou kunnen aanpakken.

Aptameren zijn korte nucleïnezuursequenties die specifiek voor een bepaald doelwit worden geproduceerd. Systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) is een veelgebruikte methode bij de productie van aptameren. In SELEX wordt het eiwit van belang geïncubeerd met een bibliotheek van willekeurige nucleotidesequenties en door middel van een reeks iteratieve cycli wordt de aptamer die specifiek is voor dat eiwit gezuiverd. Aptamers hebben een vergelijkbare selectiviteit en specificiteit als mAbs, en daarom laat de ontwikkeling van geneesmiddelen op dit gebied veelbelovende toekomstige toepassingen zien. Aptameren die specifiek zijn voor kankerbiomarkers kunnen worden toegepast als afzonderlijke geneesmiddelen en diagnostische hulpmiddelen voor kanker ^5,6,7. Vanwege hun nano-formaat structuur kunnen deze aptameren ook fungeren als medicijndragers om cytotoxische middelen specifiek aan de tumor af te leveren⁸. Dit zou de werkzaamheid van gerichte medicijnafgifte verhogen en chemotherapie-geassocieerde, off-target bijwerkingen verminderen. Bovendien hebben deze nanogeneesmiddelen een hoge weefselpenetratie, waardoor ze een wenselijke kandidaat zijn voor toediening en behandeling van geneesmiddelen met diepe tumoren. Aptameren kunnen ook worden ontworpen om zich te richten op de transporters die tot expressie komen op de bloed-hersenbarrière (BBB) om de medicijnafgifte aan hersentumoren te verbeteren⁹. Een goed voorbeeld van zo’n aptamer zijn bifunctionele aptameren, gericht op de transferrinereceptor (TfR)¹⁰ om de medicijnafgifte over de BBB te verbeteren en een cytotoxische medicijnlading aan tumorcellen te leveren¹¹.

Ondanks alle voordelen van aptameren, heeft de ontwikkeling van geneesmiddelen op dit gebied nog geen op de markt gebracht, succesvol medicijn tegen kanker opgeleverd. Een reden hiervoor zou het gebrek aan standaard en reproduceerbare methoden kunnen zijn die wereldwijd kunnen worden gevolgd door onderzoekers in het veld. In dit artikel wordt een stapsgewijs protocol van een aptamerbinding aan een inheems eiwit op het celoppervlak gedemonstreerd. Dit protocol is een eerste vereiste stap in de preklinische beoordeling van antikanker aptameren. De test wordt uitgevoerd om de selectiviteit en specificiteit aan te tonen van de gezuiverde aptamer verzameld uit SELEX of een gepubliceerde aptamersequentie voor bevestiging van selectiviteit en specificiteit. Deze flowcytometrische assay is een snelle, betrouwbare, gevoelige test die nauwkeurig de selectiviteit en specificiteit van het aptamer laat zien, waarbij de aptamer wordt getest tegen eiwitten op het celoppervlak 12,13,14. Deze methode wordt gedemonstreerd met behulp van de binding van een aptamer specifiek voor EpCAM getoond in dit artikel¹⁵. EpCAM, als een transmembraan glycoproteïne, speelt een rol bij tumorcelsignalering, progressie, migratie en metastase^16,17. Om de selectiviteit en specificiteit van deze aptamer aan te tonen, werden EpCAM-positieve en -negatieve kankercellen gebruikt. De eerder ontwikkelde EpCAM-specifieke aptamer, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), en een negatieve controle aptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), werden gebruikt als EpCAM-bindende en -niet-bindende aptameren, respectievelijk¹⁰. Het 3′-uiteinde van zowel TEPP als TENN werd gelabeld met een TYE665-fluorofoor.

TEPP is een bifunctionele aptamer die zich richt op EpCAM van het ene uiteinde en TfR van het andere uiteinde. Dit heeft TEPP een geschikte kandidaat gemaakt voor medicijnafgifte aan EpCAM ⁺ hersentumoren. Met behulp van het TfR-specifieke uiteinde doorkruist TEPP de bloed-hersenbarrière en met behulp van het EpCAM-specifieke uiteinde vindt het de tumor en levert het zijn lading (bijv. Cytotoxische geneesmiddelen) aan de tumor. TENN heeft een vergelijkbare lengte en 2D-structuur als TEPP, maar het heeft geen affiniteit voor de EpCAM of TfR en is daarom een geschikte negatieve controle aptamer. Met behulp van TEPP en TENN wordt in dit artikel het testen van de binding van een aptamer aan het doeleiwit met behulp van flowcytometrie getoond. Dit protocol is van toepassing op de ontwikkeling van celspecifieke aptameren. Het is ook van toepassing op verdere complementaire en bevestigingsanalyses van de aptamersequenties die beschikbaar zijn in de literatuur. Het protocol kan ook worden gebruikt door degenen die nieuw zijn in het aptamer-veld en die kijken naar het gebruik van een eerder gepubliceerde aptamer voor hun onderzoeks- en ontwikkelingsdoeleinden (R &D). In dit artikel worden twee aptamersequenties bestudeerd die beschikbaar zijn in de literatuur.

Protocol

OPMERKING: Draag voordat u met het experiment begint persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen en een bril. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. 1. Buffers vereist voor de test Bereid de buffers die nodig zijn voor dit experiment – de SELEX-buffer die nodig is voor aptamervouwen, Blocking Buffer (BB), Wash Buffer (W…

Representative Results

Een belangrijk aspect van de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is het verzekeren van de selectiviteit en specificiteit van het kandidaat-geneesmiddel. Dit betekent dat het kandidaat-geneesmiddel in staat moet zijn om onderscheid te maken tussen verschillende cellen en alleen de celpopulatie van belang moet beïnvloeden (selectiviteit). Selectiviteit wordt bestudeerd met behulp van cellijnen die verschillen in termen van expressie van het eiwit van belang. In deze studie werden MDA-MB-231 en HEK 293T ce…

Discussion

De belangrijkste uitdaging bij het ontwikkelen van nieuwe aptameren is het ontbreken van standaardrichtlijnen die van toepassing zijn op verschillende stappen van dit proces. McKeague et al. hebben onlangs enkele van de bijbehorende uitdagingen aangetoond, die leiden tot onduidelijke presentaties van gegevens in publicaties en het niet repliceren van het onderzoek. Zij stelden fundamentele richtlijnen voor die nodig zijn om in aanmerking te komen bij het karakteriseren van aptameren¹⁹. Een aptamer…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid	Sigma-Aldrich	T6649
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube	Greiner Bio One	188271
5 mL serological pipettes	Greiner Bio One	606180
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer	Becton Dickinson	N/A
BD FACSDiva V9.0	BD Biosciences	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder	Sigma-AldrichTM	A7906-50G
Bright-line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder	Life Technologies	12100046
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21300025
FlowJo, LLC 10.8.1	BD Biosciences	N/A
Foetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	SFBS-F
HEK293T	American Type Culture Collection	ACS-4500
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	N/A
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	N/A
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
MDA-MB-231	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black	Greiner Bio One	655076
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets	Life Technologies	18912014
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water	Milli-Q
T75 Cell Culture flask	Cellstar	658170
TENN	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPP	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)	Sigma-Aldrich	R8508-5X1ML
Trypan Blue Solution	Life Technologies	15250061
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054