항암 압타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위한 유세포분석 기반 세포 표면 단백질 결합 분석
Summary
항암 앱타머 개발에 필요한 단계는 표적에 대한 결합을 테스트하는 것입니다. 우리는 이 결합을 연구하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 시연하며, 특정 단백질에 대해 음성 대조군 압타머와 양성 또는 음성 암세포를 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.
Abstract
항암 앱타머 개발의 핵심 과제는 개발된 앱타머의 표적 단백질에 대한 선택성과 특이성을 효율적으로 결정하는 것입니다. 단일 클론 항체에 비해 몇 가지 장점으로 인해 압타머 개발은 암 연구자들 사이에서 엄청난 인기를 얻었습니다. 지수 농축 (SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화는 관심 단백질에 특이적인 압타머를 개발하는 가장 일반적인 방법입니다. SELEX에 이어 빠르고 효율적인 결합 분석은 식별 과정을 가속화하여 압타머의 선택성과 특이성을 확인합니다.
이 논문은 상피 세포 접착 분자(EpCAM)에 특이적인 압타머의 단계별 유세포 분석 기반 결합 분석을 설명합니다. 막횡단 당단백질 EpCAM은 대부분의 암종에서 과발현되며 암 시작, 진행 및 전이에 역할을 합니다. 따라서, 종양으로의 표적 약물 전달을 위한 귀중한 후보이다. 막 결합된 EpCAM에 대한 앱타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위해서는 EpCAM 양성 및 음성 세포가 필요하다. 추가적으로, EpCAM 결합 압타머와 유사한 길이 및 2차원(2D) 구조를 갖는 비결합 EpCAM 압타머가 요구된다. 결합 분석은 상이한 완충제 (블로킹 완충액, 세척 완충액, 인큐베이션 완충액, 및 FACS 완충액) 및 배양 단계를 포함한다.
앱타머는 세포주와 함께 배양된다. 인큐베이션 및 세척 단계에 이어서, 세포를 민감성 유동 세포분석 방법을 사용하여 평가할 것이다. 결과를 분석한 결과, EpCAM 음성 세포가 아닌 EpCAM 양성 세포에 대한 EpCAM 특이적 압타머의 결합을 보여준다. EpCAM 양성 세포에서, 이것은 비결합 압타머 대조군과 비교하여 EpCAM 압타머의 우측으로의 결합에서의 밴드 이동으로서 도시된다. EpCAM 음성 세포에서, EpCAM 결합 및 비 결합 압타머의 상응하는 밴드가 겹친다. 이것은 EpCAM 압타머의 선택성과 특이성을 입증합니다. 이 프로토콜은 EpCAM 압타머에 초점을 맞추고 있지만, 프로토콜은 다른 공개된 압타머에도 적용할 수 있다.
Introduction
암은 여전히 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다1. 최근 수십 년 동안 암 치료의 상당한 개선에도 불구하고 항암제 개발은 여전히 논쟁의 여지가 많은 주제입니다. 암 치료의 주류 인 화학 요법은 환자의 치료 순응도를 제한하는 심각한 부작용을 동반하기 때문입니다. 더욱이, 화학 요법으로 유발 된 암 내성은 의학적 개입의 유일한 선택으로서의 적용을 제한했다. 단클론 항체(mAbs)의 적용은 암 치료에 대한 향상된 반응을 도입했습니다2. mAb를 사용한 이유는 화학 요법의 효능을 개선하고 부작용을 최소화하는 것이 었습니다. 그러나 mAb의 관리도 도전이되었습니다. 이는 mAb 유도 면역반응뿐만 아니라 동물의존적이고 고가의 생산 비용과 어려운보관 조건 때문이었습니다3. 1990년대에 압 타머의 도입4 앱타머의 적용이 mAb와 관련된 문제를 해결할 수 있기 때문에 암 치료에 대한 새로운 희망을 불러일으켰습니다.
압타머는 특정 표적에 대해 특이적으로 생산되는 짧은 핵산 서열입니다. 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화는 압타머 생산에서 일반적인 방법입니다. SELEX에서 관심 단백질은 무작위 뉴클레오티드 서열 라이브러리와 함께 배양되고 일련의 반복 주기를 통해 해당 단백질에 특이적인 앱타머가 정제됩니다. 압타머는 mAb와 유사한 표적 선택성 및 특이성을 가지므로 이 분야의 약물 개발은 유망한 미래 응용 분야를 보여줍니다. 암 바이오마커에 특이적인 압타머는 단일 약물 및 암 진단 도구 5,6,7로서 적용될 수 있다. 이들의 나노 크기 구조로 인해, 이들 앱타머는 또한 종양에 특이적으로 세포독성제를 전달하는 약물 운반체로서 작용할 수 있다(8). 이것은 표적 약물 전달의 효능을 증가시키고 화학 요법과 관련된 표적 외 부작용을 감소시킵니다. 또한, 이러한 나노 의약품은 조직 침투율이 높기 때문에 심부 종양 약물 전달 및 치료에 바람직한 후보가됩니다. 압타머는 또한 뇌종양으로의 약물 전달을 개선하기 위해 혈액-뇌 장벽(BBB) 상에 발현된 수송체를 표적으로 하도록 설계될 수있다9. 이러한 앱타머의 좋은 예는 BBB를 가로지르는 약물 전달을 향상시키기 위해 트랜스페린 수용체(TfR)10을 표적화하고, 종양 세포(11)에 세포독성 약물 페이로드를 전달하는 이관능성 앱타머이다.
압타머의 모든 장점에도 불구하고 이 분야의 약물 개발은 아직 시판되고 성공적인 항암제를 산출하지 못했습니다. 그 이유 중 하나는 해당 분야의 연구자들이 전 세계적으로 따를 수 있는 표준적이고 재현 가능한 방법이 부족하기 때문일 수 있습니다. 이 논문에서는 세포 표면에 발현된 천연 단백질에 결합하는 앱타머의 단계별 프로토콜을 시연합니다. 이 프로토콜은 항암 앱타머의 전임상 평가에서 전제 조건 단계입니다. 분석법은 선택성 및 특이성의 확인을 위해 SELEX 또는 공개된 압타머 서열로부터 수집된 정제된 압타머의 선택성 및 특이성을 보여주기 위해 수행된다. 이 유세포 분석 기반 분석은 압타머의 선택성과 특이성을 정확하게 보여주는 빠르고 신뢰할 수 있으며 민감한 분석이며, 여기서 압타머는 세포 표면12,13,14의 단백질에 대해 테스트됩니다. 이 방법은 이 논문15에 나타낸 EpCAM에 특이적인 압타머의 결합을 사용하여 입증된다. 막횡단 당단백질인 EpCAM은 종양 세포 신호 전달, 진행, 이동 및 전이에 역할을 합니다16,17. 이 압타머의 선택성 및 특이성을 보여주기 위해, EpCAM 양성 및 음성 암세포가 사용되었다. 이전에 개발된 EpCAM 특이적 압타머인 TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) 및 음성 대조군 압타머인 TENN (5′-GC GCG TGCA CGC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), 각각10개의 EpCAM 결합 및 비결합 압타머를 사용하였다. TEPP 및 TENN 모두의 3′ 말단은 TYE665 형광단으로 표지되었다.
TEPP는 한쪽 끝에서 EpCAM을 표적으로 하고 다른 쪽 끝에서 TfR을 표적으로 하는 이중 기능 압타머입니다. 이로 인해 TEPP는 EpCAM+ 뇌종양에 대한 약물 전달에 적합한 후보가 되었습니다. TEPP는 TfR 특이적 말단을 사용하여 혈액-뇌 장벽을 횡단하고 EpCAM 특이적 말단을 사용하여 종양을 찾아 화물(예: 세포독성 약물)을 종양에 전달합니다. TENN은 TEPP와 유사한 길이 및 2D 구조를 갖지만 EpCAM 또는 TfR에 대한 친화력이 없으므로 적합한 음성 대조군 압타머입니다. TEPP 및 TENN을 사용하여 유세포 분석을 사용하여 표적 단백질에 대한 압타머의 결합을 테스트하는 것이 이 논문에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 세포 특이적 압타머의 개발에 적용됩니다. 또한 문헌에서 이용 가능한 압타머 서열의 추가 보완 및 확인 분석에도 적용 가능하다. 이 프로토콜은 또한 이전에 발표 된 압타머를 연구 개발 (R & D) 목적으로 사용하려는 압타머 분야를 처음 접하는 사람들도 사용할 수 있습니다. 이 논문에서는 문헌에서 이용 가능한 두 가지 압타머 서열을 연구합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
새로운 압타머 개발의 주요 과제는 이 프로세스의 여러 단계에 적용되는 표준 지침이 없다는 것입니다. McKeague et al.은 최근 출판물에서 데이터의 불분명 한 표현과 연구 복제 실패로 이어지는 관련 문제 중 일부를 보여주었습니다. 그들은 압타머19를 특성화할 때 고려해야 할 기본 지침을 제안했습니다. 압타머 결합 분석은 해당 분야의 연구자들이 널리 사용하는 압타머<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 정신 및 신체 건강 및 임상 번역 연구소 (IMPACT) SEED 기금, 디킨 대학의 “Alfred Deakin 박사후 연구 펠로우십”프로그램 및 “호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금”을 인정합니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
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