En flowcytometribasert proteinbindingsanalyse for celleoverflate for å vurdere selektivitet og spesifisitet av en anticancer aptamer

Summary

Et nødvendig skritt i anticancer aptamer utvikling er å teste sin binding til målet. Vi demonstrerer en flowcytometrisk-basert analyse for å studere denne bindingen, og understreker viktigheten av å inkludere en negativ kontrollaptamer og kreftceller som er positive eller negative for det aktuelle proteinet.

Abstract

En sentral utfordring i utviklingen av en anticancer aptamer er å effektivt bestemme selektiviteten og spesifisiteten til den utviklede aptameren til målproteinet. På grunn av sine flere fordeler i forhold til monoklonale antistoffer, har aptamer utvikling fått enorm popularitet blant kreftforskere. Systematisk utvikling av ligander ved eksponentiell anrikning (SELEX) er den vanligste metoden for å utvikle aptamerer som er spesifikke for proteiner av interesse. Etter SEALEX akselererer en rask og effektiv bindingsanalyse identifikasjonsprosessen, og bekrefter selektiviteten og spesifisiteten til aptameren.

Dette papiret forklarer en trinnvis flowcytometrisk-basert bindingsanalyse av en aptamer spesifikk for epitelial cellulær adhesjonsmolekyl (EpCAM). Det transmembrane glykoproteinet EpCAM er overuttrykket i de fleste karsinomer og spiller roller i kreftinitiering, progresjon og metastase. Derfor er det en verdifull kandidat for målrettet legemiddellevering til svulster. For å evaluere selektiviteten og spesifisiteten til aptameren til membranbundet EpCAM, kreves EpCAM-positive og -negative celler. I tillegg er det nødvendig med en ikke-bindende EpCAM-aptamer med tilsvarende lengde og 2-dimensjonal (2D) struktur som EpCAM-bindende aptamer. Bindingsanalysen omfatter forskjellige buffere (blokkeringsbuffer, vaskebuffer, inkubasjonsbuffer og FACS-buffer) og inkubasjonstrinn.

Aptameren inkuberes med cellelinjene. Etter inkubasjons- og vasketrinnene vil cellene bli evaluert ved hjelp av en sensitiv flowcytometrianalyse. Analyse av resultatene viser bindingen av den EpCAM-spesifikke aptameren til EpCAM-positive celler og ikke de EpCAM-negative cellene. I EpCAM-positive celler er dette avbildet som et båndskifte i bindingen av EpCAM-aptameren til høyre sammenlignet med den ikke-bindende aptamerkontrollen. I EpCAM-negative celler overlapper de tilsvarende båndene av EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamerer. Dette demonstrerer selektiviteten og spesifisiteten til EpCAM-aptameren. Mens denne protokollen er fokusert på EpCAM aptamer, er protokollen gjeldende for andre publiserte aptamers.

Introduction

Kreft er fortsatt en av de viktigste årsakene til dødelighet over hele verden¹. Til tross for den betydelige forbedringen i kreftbehandling de siste tiårene, er utvikling av kreftmedisiner fortsatt et svært omdiskutert tema. Dette skyldes at kjemoterapi, som bærebjelke i kreftbehandling, er ledsaget av alvorlige bivirkninger som begrenser pasientens overholdelse av behandlingen. Videre har kjemoterapi-indusert kreftresistens mot behandling begrenset sin anvendelse som det eneste valget av medisinsk inngrep. Anvendelsen av monoklonale antistoffer (mAbs) introduserte en forbedret respons på kreftbehandlinger². Begrunnelsen for å bruke mAbs var å forbedre effekten av kjemoterapeutika og minimere bivirkningene. Men administrasjonen av mAbs ble også en utfordring. Dette var ikke bare på grunn av de mAb-induserte immunologiske reaksjonene, men også på grunn av dyreavhengige og dyre produksjonskostnader og vanskelige lagringsforhold³. Innføring av aptamers på 1990-tallet⁴ reiste nye forhåpninger i kreftbehandling, da anvendelsen av aptamers kunne løse utfordringene knyttet til mAbs.

Aptamerer er korte nukleinsyresekvenser som er spesielt produsert for et bestemt mål. Systematisk utvikling av ligander ved eksponentiell anrikning (SELEX) er en vanlig metode i aptamerproduksjon. I SELEX inkuberes proteinet av interesse med et bibliotek av tilfeldige nukleotidsekvenser, og gjennom en serie iterative sykluser renses aptameren som er spesifikk for det proteinet. Aptamerer har lignende målselektivitet og spesifisitet som mAbs, og derfor viser stoffutvikling på dette feltet lovende fremtidige applikasjoner. Aptamerer som er spesifikke for kreftbiomarkører, kan brukes som enkeltmedisiner og kreftdiagnostiske verktøy ^5,6,7. På grunn av deres nanostørrelsesstruktur kan disse aptamerene også fungere som legemiddelbærere for å levere cytotoksiske midler spesielt til svulsten⁸. Dette vil øke effekten av målrettet legemiddellevering og redusere kjemoterapi-assosierte, off-target bivirkninger. Videre har disse nanomedisinene en høy vevspenetrasjon, noe som gjør dem til en ønskelig kandidat for levering og behandling av dyp tumormedisin. Aptamers kan også utformes for å målrette transportørene uttrykt på blod-hjernebarrieren (BBB) for å forbedre legemiddellevering til hjernesvulster⁹. Et godt eksempel på en slik aptamer er bifunksjonelle aptamerer, rettet mot transferrinreseptoren (TfR)¹⁰ for å forbedre legemiddelleveringen over BBB, og levere en cytotoksisk legemiddelnyttelast til tumorceller¹¹.

Til tross for alle fordelene med aptamerer, har stoffutvikling på dette feltet ennå ikke gitt et markedsført, vellykket anticancermedikament. En årsak til dette kan være mangelen på standard og reproduserbare metoder som kan følges globalt av forskere på feltet. I dette papiret demonstreres en trinnvis protokoll av en aptamerbinding til et innfødt protein uttrykt på celleoverflaten. Denne protokollen er et nødvendig trinn i den prekliniske vurderingen av anticancer aptamers. Analysen utføres for å vise selektiviteten og spesifisiteten til den rensede aptameren samlet inn fra SELEX eller en publisert aptamersekvens for bekreftelse av selektivitet og spesifisitet. Denne flowcytometriske analysen er en rask, pålitelig, sensitiv analyse som nøyaktig viser selektiviteten og spesifisiteten til aptameren, hvor aptameren blir testet mot proteiner på celleoverflaten^12,13,14. Denne metoden er demonstrert ved hjelp av bindingen av en aptamer spesifikk for EpCAM vist i denne artikkelen¹⁵. EpCAM, som et transmembrant glykoprotein, spiller roller i tumorcellesignalering, progresjon, migrasjon og metastase^16,17. For å vise selektiviteten og spesifisiteten til denne aptameren ble EpCAM-positive og -negative kreftceller brukt. Den tidligere utviklede EpCAM-spesifikke aptameren, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), og en negativ kontrollaptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), ble brukt som henholdsvis EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamerer, henholdsvis¹⁰. 3′-enden av både TEPP og TENN ble merket med en TYE665 fluorofor.

TEPP er en bifunksjonell aptamer som retter seg mot EpCAM fra den ene enden og TfR i den andre. Dette har gjort TEPP til en egnet kandidat for legemiddellevering til EpCAM⁺ hjernesvulster. Ved hjelp av sin TfR-spesifikke ende krysser TEPP blod-hjernebarrieren, og ved hjelp av den EpCAM-spesifikke enden finner svulsten og leverer lasten (f.eks. Cytotoksiske stoffer) til svulsten. TENN har en lignende lengde og 2D-struktur som TEPP, men den har ikke affinitet for EpCAM eller TfR, og er derfor en passende negativ kontrollaptamer. Ved hjelp av TEPP og TENN er testing av bindingen av en aptamer til målproteinet ved hjelp av flowcytometri vist i denne artikkelen. Denne protokollen gjelder for utvikling av cellespesifikke aptamerer. Det er også aktuelt for ytterligere komplementære og bekreftelsesanalyser av aptamersekvensene som er tilgjengelige i litteraturen. Protokollen kan også brukes av de som er nye i aptamerfeltet som ser på å bruke en tidligere publisert aptamer for deres forsknings- og utviklingsformål (FoU). I denne artikkelen studeres to aptamersekvenser som er tilgjengelige i litteraturen.

Protocol

MERK: Før du starter eksperimentet, bruk personlig verneutstyr, inkludert laboratoriefrakk, hansker og vernebriller. Se materialtabellen for detaljer om materialer, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen. 1. Buffere som kreves for analysen Forbered bufferne som kreves for dette eksperimentet – SELEX-bufferen som kreves for aptamerfolding, Blocking Buffer (BB), Wash Buffer (WB) og Binding Buffer (BiB) (Tabell 1</stron…

Representative Results

Et viktig aspekt ved oppdagelse og utvikling av nye legemidler er å sikre selektiviteten og spesifisiteten til legemiddelkandidaten. Dette betyr at legemiddelkandidaten skal kunne diskriminere mellom ulike celler og kun påvirke cellepopulasjonen av interesse (selektivitet). Selektivitet studeres ved hjelp av cellelinjer som er forskjellige når det gjelder ekspresjon av proteinet av interesse. I denne studien ble MDA-MB-231 og HEK 293T cellelinjer valgt som EpCAM-positive og -negative celler. Spesifisitet er en annen d…

Discussion

Hovedutfordringen med å utvikle nye aptamerer er mangelen på standardretningslinjer som gjelder for ulike trinn i denne prosessen. McKeague og medarbeidere har nylig demonstrert noen av de tilhørende utfordringene, noe som fører til uklare presentasjoner av data i publikasjoner og manglende replikering av forskningen. De foreslo grunnleggende retningslinjer som er nødvendige for å vurdere karakterisering av aptamers¹⁹. En aptamerbindingsanalyse er et kritisk trinn i screening og / eller kara…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid	Sigma-Aldrich	T6649
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube	Greiner Bio One	188271
5 mL serological pipettes	Greiner Bio One	606180
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer	Becton Dickinson	N/A
BD FACSDiva V9.0	BD Biosciences	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder	Sigma-AldrichTM	A7906-50G
Bright-line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder	Life Technologies	12100046
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21300025
FlowJo, LLC 10.8.1	BD Biosciences	N/A
Foetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	SFBS-F
HEK293T	American Type Culture Collection	ACS-4500
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	N/A
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	N/A
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
MDA-MB-231	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black	Greiner Bio One	655076
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets	Life Technologies	18912014
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water	Milli-Q
T75 Cell Culture flask	Cellstar	658170
TENN	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPP	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)	Sigma-Aldrich	R8508-5X1ML
Trypan Blue Solution	Life Technologies	15250061
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054