Um passo necessário no desenvolvimento do aptâmero anticâncer é testar sua ligação ao alvo. Demonstramos um ensaio baseado em citometria de fluxo para estudar essa ligação, enfatizando a importância de incluir um aptâmero de controle negativo e células cancerígenas que são positivas ou negativas para essa proteína em particular.
Um dos principais desafios no desenvolvimento de um aptâmero anticâncer é determinar eficientemente a seletividade e a especificidade do aptâmero desenvolvido para a proteína alvo. Devido às suas várias vantagens sobre os anticorpos monoclonais, o desenvolvimento do aptâmero ganhou enorme popularidade entre os pesquisadores do câncer. A evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é o método mais comum de desenvolvimento de aptâmeros específicos para proteínas de interesse. Após o SELEX, um ensaio de ligação rápido e eficiente acelera o processo de identificação, confirmando a seletividade e especificidade do aptâmero.
Este artigo explica um ensaio de ligação baseado em citometria de fluxo passo-a-passo de um aptâmero específico para molécula de adesão celular epitelial (EpCAM). A glicoproteína transmembrana EpCAM é superexpressa na maioria dos carcinomas e desempenha papéis no início, progressão e metástase do câncer. Portanto, é um candidato valioso para a entrega de medicamentos direcionados aos tumores. Para avaliar a seletividade e a especificidade do aptâmero para a EpCAM ligada à membrana, são necessárias células positivas e negativas para EpCAM. Além disso, é necessário um aptâmero EpCAM não vinculativo com um comprimento e estrutura 2-dimensional (2D) semelhantes ao aptâmero de ligação ao EpCAM. O ensaio de ligação inclui diferentes buffers (buffer de bloqueio, buffer de lavagem, buffer de incubação e buffer FACS) e etapas de incubação.
O aptâmero é incubado com as linhas celulares. Após as etapas de incubação e lavagem, as células serão avaliadas por meio de um ensaio de citometria de fluxo sensível. A análise dos resultados mostra a ligação do aptâmero específico do EpCAM às células positivas para EpCAM e não às células negativas para EpCAM. Em células positivas para EpCAM, isso é descrito como um deslocamento de banda na ligação do aptâmero EpCAM à direita em comparação com o controle do aptâmero não ligante. Em células EpCAM-negativas, as bandas correspondentes de aptâmeros de ligação e não ligação a EpCAM se sobrepõem. Isso demonstra a seletividade e a especificidade do aptamer EpCAM. Enquanto este protocolo é focado no aptâmero EpCAM, o protocolo é aplicável a outros aptâmeros publicados.
O câncer ainda é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo1. Apesar da melhoria significativa no tratamento do câncer nas últimas décadas, o desenvolvimento de medicamentos anticâncer ainda é um tópico altamente debatido. Isso ocorre porque a quimioterapia, como a base do tratamento do câncer, é acompanhada por efeitos colaterais graves que limitam a adesão do paciente ao tratamento. Além disso, a resistência ao tratamento do câncer induzida pela quimioterapia restringiu sua aplicação como a única escolha de intervenção médica. A aplicação de anticorpos monoclonais (mAbs) introduziu uma resposta aprimorada aos tratamentos contra o câncer2. A lógica do uso de mAbs foi melhorar a eficácia dos quimioterápicos e minimizar suas reações adversas. No entanto, a administração de mAbs também se tornou um desafio. Isso não ocorreu apenas por causa das reações imunológicas induzidas por mAb, mas também devido aos custos de produção caros e dependentes de animais e às difíceis condições de armazenamento3. A introdução dos aptâmerosna década de 19904 levantou novas esperanças no tratamento do câncer, já que a aplicação de aptâmeros poderia enfrentar os desafios associados ao mAbs.
Aptamers são sequências curtas de ácidos nucleicos que são produzidas especificamente para um determinado alvo. A evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é um método comum na produção de aptâmeros. No SELEX, a proteína de interesse é incubada com uma biblioteca de sequências aleatórias de nucleotídeos e, através de uma série de ciclos iterativos, o aptâmero específico para essa proteína é purificado. Os aptâmeros têm seletividade e especificidade de alvo semelhantes aos mAbs e, portanto, o desenvolvimento de medicamentos neste campo mostra aplicações futuras promissoras. Aptamers específicos para biomarcadores de câncer poderiam ser aplicados como medicamentos únicos e ferramentas de diagnóstico de câncer 5,6,7. Devido à sua estrutura nanométrica, esses aptâmeros também poderiam atuar como portadores de fármacos para fornecer agentes citotóxicos especificamente ao tumor8. Isso aumentaria a eficácia da administração direcionada de medicamentos e diminuiria as reações adversas fora do alvo associadas à quimioterapia. Além disso, esses nanomedicamentos têm uma alta penetração tecidual, o que os torna um candidato desejável para a entrega e tratamento de medicamentos de tumores profundos. Os aptâmeros também podem ser projetados para atingir os transportadores expressos na barreira hematoencefálica (BBB) para melhorar a entrega de drogas a tumores cerebrais9. Um bom exemplo de tal aptâmero são os aptâmeros bifuncionais, visando o receptor de transferrina (TfR)10 para melhorar a entrega de drogas em todo o BBB e entregando uma carga útil de drogas citotóxicas às células tumorais11.
Apesar de todas as vantagens dos aptâmeros, o desenvolvimento de medicamentos neste campo ainda não produziu um medicamento anticâncer comercializado e bem-sucedido. Uma razão para isso pode ser a falta de métodos padrão e reprodutíveis que poderiam ser seguidos globalmente por pesquisadores da área. Neste trabalho, um protocolo passo-a-passo de um aptâmero se ligando a uma proteína nativa expressa na superfície celular é demonstrado. Este protocolo é uma etapa pré-requisito na avaliação pré-clínica de aptâmeros anticancerígenos. O ensaio é realizado para mostrar a seletividade e especificidade do aptâmero purificado coletado do SELEX ou uma sequência de aptâmeros publicada para confirmação da seletividade e especificidade. Este ensaio baseado em citometria de fluxo é um ensaio rápido, confiável e sensível que mostra com precisão a seletividade e a especificidade do aptâmero, onde o aptâmero está sendo testado contra proteínas na superfície celular12,13,14. Este método é demonstrado usando a ligação de um aptâmero específico para EpCAM mostrado neste trabalho15. A EpCAM, como glicoproteína transmembrana, desempenha papéis na sinalização, progressão, migração e metástase de células tumorais16,17. Para mostrar a seletividade e especificidade deste aptâmero, foram utilizadas células cancerígenas positivas e negativas para EpCAM. O aptâmero específico de EpCAM previamente desenvolvido, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), e um aptâmero controle negativo, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), foram utilizados como aptâmeros ligantes e não ligantes de EpCAM, respectivamente10. A extremidade 3′ do TEPP e do TENN foi marcada com um fluoróforo TYE665.
O TEPP é um aptâmero bifuncional que tem como alvo o EpCAM de uma extremidade e o TfR do outro. Isso tornou o TEPP um candidato adequado para a administração de medicamentos para tumores cerebrais EpCAM +. Usando sua extremidade específica da TfR, a TEPP atravessa a barreira hematoencefálica e, usando a extremidade específica da EpCAM, encontra o tumor e entrega sua carga (por exemplo, drogas citotóxicas) ao tumor. O TENN tem um comprimento e uma estrutura 2D semelhantes ao TEPP, mas não tem afinidade com o EpCAM ou TfR e, portanto, é um aptâmero de controle negativo adequado. Usando TEPP e TENN, testar a ligação de um aptâmero à proteína-alvo usando citometria de fluxo é mostrado neste artigo. Este protocolo aplica-se ao desenvolvimento de aptâmeros específicos de células. Também é aplicável a outras análises complementares e de confirmação das sequências de aptâmeros disponíveis na literatura. O protocolo também pode ser usado por aqueles novos no campo do aptâmero que estão procurando usar um aptâmero publicado anteriormente para seus fins de pesquisa e desenvolvimento (P & D). Neste trabalho, são estudadas duas sequências de aptâmeros disponíveis na literatura.
O principal desafio com o desenvolvimento de novos aptâmeros é a falta de diretrizes padrão que se aplicam a diferentes etapas desse processo. McKeague et al. demonstraram recentemente alguns dos desafios associados, que levam a apresentações pouco claras de dados em publicações e falha em replicar a pesquisa. Propuseram diretrizes fundamentais necessárias para a consideração na caracterização dos aptâmeros19. Um ensaio de ligação de aptâmeros é uma etapa crítica na triagem e/ou …
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem o financiamento do SEED do Instituto de Saúde Mental e Física e Tradução Clínica (IMPACT), o programa “Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship” da Universidade de Deakin e a “Bolsa de Estudo do Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano”.
1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |