Séparation et prélèvement automatiques de substances liées au cancer à partir d’échantillons cliniques
Summary
Cet article décrit l’application d’équipements automatisés pour séparer et collecter facilement et efficacement des substances, telles que l’ADN acellulaire et les cellules tumorales circulantes, à partir du sang total.
Abstract
Récemment, des biopsies liquides ont été utilisées pour diagnostiquer diverses maladies, y compris le cancer. Les fluides corporels contiennent de nombreuses substances, y compris des cellules, des protéines et des acides nucléiques provenant de tissus normaux, mais certaines de ces substances proviennent également de la zone malade. L’investigation et l’analyse de ces substances dans les fluides corporels jouent un rôle central dans le diagnostic de diverses maladies. Par conséquent, il est important de séparer avec précision les substances requises, et plusieurs techniques sont développées à cette fin.
Nous avons développé un appareil et une plate-forme de type laboratoire sur disque nommé CD-PRIME. Cet appareil est automatisé et donne de bons résultats pour la contamination et la stabilité des échantillons. De plus, il présente les avantages d’un bon rendement d’acquisition, d’un temps de fonctionnement court et d’une reproductibilité élevée. En outre, selon le type de disque à monter, le plasma contenant de l’ADN acellulaire, les cellules tumorales circulantes, les cellules mononucléées du sang périphérique ou les couches leucocytaires peuvent être séparés. Ainsi, l’acquisition d’une variété de matériaux présents dans les fluides corporels peut être faite pour une variété d’applications en aval, y compris l’étude des omiques.
Introduction
La détection précoce et précise de diverses maladies, y compris le cancer, est le facteur le plus important dans l’établissement d’une stratégie de traitement 1,2,3,4. En particulier, la détection précoce du cancer est étroitement liée à l’augmentation des chances de survie du patient 5,6,7,8. Récemment, les biopsies liquides ont été sous les projecteurs pour la détection précoce du cancer. Les tumeurs solides subissent une angiogenèse et libèrent diverses substances dans le sang. En particulier, des ADN circulants (ADNct), des ARN circulants (ARNct), des protéines, des vésicules telles que les exosomes et des cellules tumorales circulantes (CTC) ont été trouvés dans le sang de patients cancéreux 2,9. Bien qu’il existe des différences dans la quantité de ces substances, elles sont systématiquement observées non seulement dans les premiers stades, mais aussi dans les derniers stades 6,10. Cependant, ces différences individuelles sont très élevées; par exemple, la quantité d’ADN acellulaire (cfDNA) contenant de l’ADNct est inférieure à 1 000 ng, et le nombre de CTC est inférieur à 100 dans 10 mL de sang total provenant de patients cancéreux11,12,13. De nombreuses études ont caractérisé le cancer en utilisant ces substances présentes en moindre quantité (c.-à-d. cfDNA, ADNct et CTC). Pour obtenir des résultats précis, il est important de séparer avec précision de petites quantités de substances de haute pureté13,14. Les méthodes de centrifugation conventionnelles sont couramment utilisées, mais elles sont difficiles à manipuler et ont une faible pureté en fonction des compétences de l’utilisateur. Depuis la découverte des CTC, plusieurs techniques de séparation ont été développées, telles que la centrifugation ou la séparation de grade de densité, les immunobilles et les méthodes microfluidiques. Plusieurs techniques de confinement ont été développées depuis la découverte des CTC. Cependant, ces techniques sont souvent limitées lorsqu’il est nécessaire d’isoler les cellules des différentes puces et membranes utilisées pour les isoler15. En outre, les méthodes d’étiquetage nécessitent des équipements tels que FACS, et il y a des limites au processus en aval en raison de la contamination par l’étiquetage.
Récemment, l’utilisation de biopsies liquides a augmenté et diverses études sont en cours pour la détection précoce du cancer. Bien que cette méthode soit simple, il existe encore des difficultés dans l’analyse en aval, et diverses études tentent de surmonter ces difficultés16,17. En outre, de nombreux sites, y compris les hôpitaux, nécessitent des méthodes automatisées, reproductibles et de haute pureté pratiques à utiliser. Ici, nous avons développé un laboratoire sur disque pour la séparation automatisée des substances des échantillons de sang à la suite d’une biopsie liquide. Ces dispositifs sont basés sur le principe de la centrifugation, de la microfluidique et de la capture de cellules de la taille d’un pore. Il existe trois types de disques : LBx-1 peut acquérir du plasma et une couche leucocytaire, tandis que LBx-2 peut acquérir du plasma et de la PBMC à partir de sang total d’un volume inférieur à 10 mL; FAST-auto peut également acquérir des CTC à l’aide d’une membrane amovible du disque. Jusqu’à quatre de chaque disque peuvent être utilisés en une seule fois. Surtout, l’avantage de cet appareil et de cette méthode est qu’ils peuvent obtenir une variété de substances dérivées du cancer à partir du même échantillon en utilisant une petite quantité de sang. Cela signifie que le sang du patient ne doit être prélevé qu’une seule fois. De plus, il présente l’avantage d’exclure les erreurs dues aux différences dans la période de prélèvement sanguin. Cette plateforme est facile à utiliser et fournit des résultats précis pour les biopsies liquides et les applications en aval. Dans ce protocole, l’utilisation de l’appareil et de la cartouche est introduite.
Protocol
Representative Results
Discussion
La quantité et la concentration d’ADNcf et de CTC dépendent de l’individu, du stade et du type de cancer. Cela dépend également de l’état du patient 2,4,5,10,20. En particulier, dans les stades précoces ou précancéreux du cancer, les concentrations de substances liées au cancer sont très faibles, il y a donc une forte possibilité qu’il ne pu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce manuscrit a été financé en partie par le Fonds coréen de développement des dispositifs médicaux (KMDF, subvention n° RS-2020-KD000019) et l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI, subvention n° HI19C0521020020).
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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