Separazione automatica e raccolta di sostanze correlate al cancro da campioni clinici
Summary
Questo documento descrive l’applicazione di apparecchiature automatizzate per separare e raccogliere in modo semplice ed efficiente sostanze, come il DNA privo di cellule e le cellule tumorali circolanti, dal sangue intero.
Abstract
Recentemente, le biopsie liquide sono state utilizzate per diagnosticare varie malattie, tra cui il cancro. I fluidi corporei contengono molte sostanze, tra cui cellule, proteine e acidi nucleici provenienti da tessuti normali, ma alcune di queste sostanze provengono anche dall’area malata. L’indagine e l’analisi di queste sostanze nei fluidi corporei svolgono un ruolo fondamentale nella diagnosi di varie malattie. Pertanto, è importante separare accuratamente le sostanze richieste e vengono sviluppate diverse tecniche da utilizzare a tale scopo.
Abbiamo sviluppato un tipo di dispositivo e piattaforma lab-on-a-disc chiamato CD-PRIME. Questo dispositivo è automatizzato e ha buoni risultati per la contaminazione del campione e la stabilità del campione. Inoltre, ha vantaggi di una buona resa di acquisizione, un breve tempo di funzionamento e un’elevata riproducibilità. Inoltre, a seconda del tipo di disco da montare, il plasma contenente DNA privo di cellule, cellule tumorali circolanti, cellule mononucleate del sangue periferico o buffy coat può essere separato. Pertanto, l’acquisizione di una varietà di materiali presenti nei fluidi corporei può essere effettuata per una varietà di applicazioni a valle, incluso lo studio dell’omica.
Introduction
La diagnosi precoce e accurata di varie malattie, incluso il cancro, è il fattore più importante nello stabilire una strategia di trattamento 1,2,3,4. In particolare, la diagnosi precoce del cancro è strettamente correlata all’aumento delle possibilità di sopravvivenza per il paziente 5,6,7,8. Recentemente, le biopsie liquide sono state sotto i riflettori per la diagnosi precoce del cancro. I tumori solidi subiscono angiogenesi e rilasciano varie sostanze nel sangue. In particolare, DNA circolanti (ctDNA), RNA circolanti (ctRNA), proteine, vescicole come esosomi e cellule tumorali circolanti (CTC) sono stati trovati nel sangue di pazienti oncologici 2,9. Sebbene ci siano differenze nella quantità di queste sostanze, sono costantemente osservate non solo nelle fasi iniziali ma anche nelle fasi successive 6,10. Tuttavia, queste differenze individuali sono molto elevate; ad esempio, la quantità di DNA privo di cellule (cfDNA) contenente ctDNA è inferiore a 1.000 ng e il numero di CTC è inferiore a 100 in 10 ml di sangue intero da pazienti oncologici11,12,13. Molti studi hanno caratterizzato il cancro utilizzando queste sostanze presenti in quantità minori (cioè cfDNA, ctDNA e CTC). Per ottenere risultati accurati, è importante separare accuratamente piccole quantità di sostanze con elevata purezza13,14. I metodi di centrifugazione convenzionali sono comunemente usati, ma sono difficili da gestire e hanno una bassa purezza a seconda dell’abilità dell’utente. Dalla scoperta dei CTC, sono state sviluppate diverse tecniche di separazione, come la centrifugazione o la separazione del grado di densità, l’immunobead e i metodi microfluidici. Diverse tecniche di contenimento sono state sviluppate dalla scoperta dei CTC. Tuttavia, queste tecniche sono spesso limitate quando è necessario isolare le cellule dai vari chip e membrane utilizzati per isolarle15. Inoltre, i metodi di etichettatura richiedono attrezzature come FACS e ci sono limiti al processo a valle a causa della contaminazione dell’etichettatura.
Recentemente, l’uso di biopsie liquide è aumentato e sono stati condotti vari studi per la diagnosi precoce del cancro. Sebbene questo metodo sia semplice, ci sono ancora difficoltà nell’analisi a valle, e vari studi stanno tentando di superare queste difficoltà16,17. Inoltre, molti siti, compresi gli ospedali, richiedono metodi automatizzati, riproducibili e ad alta purezza che siano convenienti da usare. Qui, abbiamo sviluppato un lab-on-a-disc per la separazione automatica delle sostanze dai campioni di sangue dopo una biopsia liquida. Questi dispositivi si basano sul principio della centrifugazione, della microfluidica e della cattura cellulare delle dimensioni dei pori. Esistono tre tipi di dischi: LBx-1 può acquisire plasma e buffy coat, mentre LBx-2 può acquisire plasma e PBMC da sangue intero con un volume inferiore a 10 ml; FAST-auto può anche acquisire CTC utilizzando una membrana rimovibile dal disco. È possibile utilizzare fino a quattro di ciascun disco in una sola esecuzione. Soprattutto, il vantaggio di questo dispositivo e metodo è che può ottenere una varietà di sostanze derivate dal cancro dallo stesso campione utilizzando una piccola quantità di sangue. Ciò significa che il sangue del paziente deve essere prelevato solo una volta. Inoltre, ha il vantaggio di escludere errori dovuti a differenze nel periodo di prelievo del sangue. Questa piattaforma è facile da usare e fornisce risultati accurati per biopsie liquide e applicazioni a valle. In questo protocollo, viene introdotto l’utilizzo del dispositivo e della cartuccia.
Protocol
Representative Results
Discussion
La quantità e la concentrazione di cfDNA e CTC dipende dall’individuo, dallo stadio e dal tipo di cancro. Dipende anche dalle condizioni del paziente 2,4,5,10,20. In particolare, nelle fasi iniziali o precancerose del cancro, le concentrazioni di sostanze correlate al cancro sono molto basse, quindi c’è un’alta possibilità che non possa essere rilevato. Tut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo manoscritto è stato sostenuto in parte dal Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) e dal Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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