בדיקת קרדיוטוקסיות בתפוקה גבוהה באמצעות מונושכבות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בוגרים
Summary
קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים (hiPSC-CMs) מציעים חלופה לשימוש בבעלי חיים לבדיקת רעילות לב פרה-קלינית. מגבלה לאימוץ נרחב של hiPSC-CMs בבדיקת רעילות פרה-קלינית היא הפנוטיפ הלא בשל, דמוי העובר של התאים. מוצגים כאן פרוטוקולים להבשלה חזקה ומהירה של hiPSC-CMs.
Abstract
קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) משמשים להחליף ולהפחית את התלות בבעלי חיים ובתאי בעלי חיים לצורך בדיקות קרדיוטוקסיות פרה-קליניות. בפורמטים חד-שכבתיים דו-ממדיים, hiPSC-CMs משחזרים את המבנה והתפקוד של תאי שריר הלב האנושיים הבוגרים כאשר הם מאורגנים בתרבית על מטריצה חוץ-תאית אופטימלית (ECM). ECM אנושי הנגזר מתאי גזע פרינטליים (מטריצה חוץ-תאית מעוררת התבגרות) מבשיל את המבנה, התפקוד והמצב המטבולי hiPSC-CM תוך 7 ימים לאחר הציפוי.
חד-שכבות hiPSC-CM בוגרות מגיבות כצפוי גם לתרופות רלוונטיות מבחינה קלינית, עם סיכון ידוע לגרימת הפרעות קצב ורעילות לב. ההבשלה של חד-שכבות hiPSC-CM היוותה מכשול לאימוץ נרחב של תאים יקרי ערך אלה למדע רגולטורי וסינון בטיחות, עד כה. מאמר זה מציג שיטות מאומתות עבור ציפוי, הבשלה ופנוטיפ פונקציונלי בתפוקה גבוהה של תפקוד אלקטרופיזיולוגי והתכווצות hiPSC-CM. שיטות אלה חלות על קרדיומיוציטים מטוהרים הזמינים באופן מסחרי, כמו גם קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע שנוצרו בתוך החברה באמצעות פרוטוקולי התמיינות יעילים ביותר, ספציפיים לחדר.
תפקוד אלקטרופיזיולוגי בתפוקה גבוהה נמדד באמצעות צבעים רגישים למתח (VSD; פליטה: 488 ננומטר), פלואורופורים רגישים לסידן (CSFs), או חיישני סידן מקודדים גנטית (GCaMP6). מכשיר מיפוי אופטי בתפוקה גבוהה משמש להקלטות אופטיות של כל פרמטר פונקציונלי, ותוכנה ייעודית מותאמת אישית משמשת לניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים. פרוטוקולי MECM מיושמים לבדיקת תרופות באמצעות אינוטרופ חיובי (איזופרנלין) וחוסמי תעלות ספציפיים לערוץ Ether-a-go-go-go (hERG). משאבים אלה יאפשרו לחוקרים אחרים להשתמש בהצלחה ב- hiPSC-CMs בוגרים לבדיקות סקר פרה-קליניות פרה-קליניות לקרדיוטוקסיות, בדיקות יעילות של תרופות לב וכלי דם ומחקר קרדיווסקולרי.
Introduction
קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) אומתו בקנה מידה בינלאומי, והם זמינים לבדיקת רעילות לב חוץ גופית 1. ניתן לייצר hiPSC-CMs טהורים במיוחד במספרים כמעט בלתי מוגבלים, לשמר בהקפאה ולהפשיר. עם הציפוי מחדש, הם גם מתעוררים לחיים ומתחילים להתכווץ בקצב המזכיר את הלב האנושי 2,3. למרבה הפלא, hiPSC-CMs בודדים מתחברים זה לזה ויוצרים סינסיטיה פונקציונלית שפועמת כרקמה אחת. כיום, hiPSCs נגזרים באופן שגרתי מדגימות דם של מטופלים, כך שכל אדם יכול להיות מיוצג באמצעות בדיקות בדיקת רעילות לב במבחנה hiPSC-CM 4,5. כך נוצרת הזדמנות לבצע “ניסויים קליניים בצלחת”, עם ייצוג משמעותי מאוכלוסיות מגוונות6.
יתרון קריטי אחד על פני גישות קיימות לבדיקת רעילות לב של תאי בעלי חיים ובעלי חיים הוא ש- hiPSC-CMs מנצלים את הגנום האנושי המלא ומציעים מערכת במבחנה עם דמיון גנטי ללב האנושי. זה אטרקטיבי במיוחד עבור פרמקוגנומיקה ורפואה מותאמת אישית – השימוש hiPSC-CMs עבור תרופות ופיתוח טיפול אחר צפוי לספק מרשמים מדויקים, מדויקים ובטוחים יותר לתרופות. ואכן, בדיקות חד-שכבתיות hiPSC-CM דו-ממדיות (2D) הוכיחו את עצמן כמנבאות רעילות לב-ריאוקסית של תרופות, באמצעות פאנל של תרופות בשימוש קליני עם סיכון ידוע לגרימת הפרעות קצב 1,7,8,9. למרות הפוטנציאל העצום של hiPSC-CMs וההבטחה לייעל ולהפוך את פיתוח התרופות לזול יותר, הייתה רתיעה משימוש בבדיקות חדשניות אלה10,11,12.
עד כה, מגבלה מרכזית אחת של אימוץ וקבלה נרחבים של בדיקות סקר hiPSC-CM היא המראה הלא בוגר והעוברי שלהם, כמו גם תפקודם. הנושא הקריטי של הבשלת hiPSC-CM נבדק ונידון בספרות המדעית ad nauseum13,14,15,16. כמו כן, גישות רבות שימשו לקידום הבשלת hiPSC-CM, כולל מניפולציות מטריצה חוץ-תאית (ECM) בחד-שכבות דו-ממדיות ופיתוח רקמות לב מהונדסות-תלת-ממדיות (EHTs)17,18. כרגע, קיימת אמונה רווחת כי השימוש ב- EHTs תלת ממדיים יספק התבגרות מעולה ביחס לגישות מבוססות חד-שכבות דו-ממדיות. עם זאת, חד-שכבות דו-ממדיות מספקות יעילות גבוהה יותר של ניצול תאים והצלחה מוגברת בציפוי בהשוואה ל-EHTs תלת-ממדיים; EHTs תלת-ממדיים משתמשים במספר גדול יותר של תאים, ולעתים קרובות דורשים הכללה של סוגי תאים אחרים שיכולים לבלבל תוצאות. לכן, במאמר זה, ההתמקדות היא בשימוש בשיטה פשוטה להבשלת hiPSC-CMs בתרבית כמונושכבות דו-ממדיות של תאים מצומדים חשמלית ומכנית.
ניתן להשיג הבשלה מתקדמת של hiPSC-CM בחד-שכבות דו-ממדיות באמצעות ECM. ניתן להבשיל את החד-שכבות הדו-ממדיות של hiPSC-CMs באמצעות כיסוי פולידימתילסילוקסאן רך וגמיש, המצופה במטריצת קרום מרתף המופרשת על ידי תא סרקומה של עכבר Engelbreth-Holm-Swarm (ECM עכבר). בשנת 2016, דיווחים הראו כי hiPSC-CMs בתרבית על מצב ECM רך זה הבשילו פונקציונלית, והציגו מהירויות הולכה פוטנציאליות פעולה ליד ערכי לב בוגר (~ 50 ס”מ לשנייה)18. יתר על כן, hiPSC-CMs בוגרים אלה הציגו מאפיינים אלקטרופיזיולוגיים רבים אחרים המזכירים את הלב הבוגר, כולל פוטנציאל קרום מנוחה היפרפולרי וביטוי של Kir2.1. לאחרונה, דיווחים זיהו ציפוי ECM אנושי שמקורו בתאי גזע פרינטליים המקדם את ההבשלה המבנית של hiPSC-CMsדו-ממדיים 19. כאן, שיטות קלות לשימוש מוצגות למונושכבות hiPSC-CM דו-ממדיות בשלות מבחינה מבנית לשימוש במסכים אלקטרופיזיולוגיים בעלי תפוקה גבוהה. יתר על כן, אנו מספקים אימות של מכשיר מיפוי אופטי לרכישה וניתוח אוטומטיים של פונקציה אלקטרופיזיולוגית חד-שכבתית דו-ממדית hiPSC-CM, תוך שימוש בצבעים רגישים למתח (VSD) ובבדיקות וחלבונים רגישים לסידן.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן מספר גישות שונות לבדיקת רעילות לב חוץ גופית באמצעות hiPSC-CMs. מאמר “שיטות עבודה מומלצות” שפורסם לאחרונה על השימוש ב- hiPSC-CMs הציג את מבחני המבחנה השונים, את הקריאות העיקריות שלהם, וחשוב מכך, את הפירוט של כל בדיקה לכימות תפקוד אלקטרופיזיולוגי של הלב האנושי20. בנוסף לשימו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH HL148068-04 ו- R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova, ., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
