成熟ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞単分子膜を用いたハイスループット心毒性スクリーニング
Summary
ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性スクリーニングに動物を使用する代替手段を提供します。前臨床毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの広範な採用に対する制限は、細胞の未熟な胎児様表現型です。ここでは、hiPSC-CMを堅牢かつ迅速に成熟させるためのプロトコルを紹介します。
Abstract
ヒト誘導幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性試験のために動物および動物細胞への依存を置き換え、軽減するために使用されます。2次元単層フォーマットでは、hiPSC-CMは、最適な細胞外マトリックス(ECM)上で培養すると、成人のヒト心筋細胞の構造と機能を再現します。ヒト周産期幹細胞由来ECM(成熟誘導細胞外マトリックス-MECM)は、プレーティング後7日でhiPSC-CMの構造、機能、代謝状態を成熟させます。
成熟したhiPSC-CM単分子膜は、臨床的に関連する薬物療法にも期待どおりに反応し、不整脈や心毒性を引き起こすリスクが知られています。hiPSC-CM単分子膜の成熟は、これまで、これらの貴重な細胞を規制科学や安全性スクリーニングに広く採用する上での障害となっていました。本稿では、hiPSC-CMの電気生理学的および収縮機能のプレーティング、成熟、ハイスループットの機能的表現型分析のための検証済みの方法を紹介します。これらの方法は、市販の精製心筋細胞だけでなく、高効率のチャンバー特異的分化プロトコルを使用して社内で生成された幹細胞由来の心筋細胞にも適用されます。
ハイスループットの電気生理学的機能は、電位感受性色素(VSD、発光:488 nm)、カルシウム感受性蛍光色素(CSF)、または遺伝子にコードされたカルシウムセンサー(GCaMP6)のいずれかを使用して測定されます。各機能パラメータの光学記録にはハイスループットの光学マッピング装置を使用し、電気生理学的データ解析にはカスタム専用ソフトウェアを使用します。MECMプロトコルは、陽性変力剤(イソプレナリン)およびヒトエーテルゴーゴー関連遺伝子(hERG)チャネル特異的遮断薬を使用した投薬スクリーニングに適用されます。これらのリソースにより、他の研究者は、ハイスループットの前臨床心毒性スクリーニング、心臓投薬効果試験、および心血管研究のために成熟したhiPSC-CMをうまく利用することができます。
Introduction
ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は国際規模で検証されており、in vitro心毒性スクリーニングに利用できます1。高純度のhiPSC-CMは、事実上無制限の数で生成し、凍結保存し、解凍することができます。再メッキすると、彼らはまた蘇生し、人間の心臓を彷彿とさせるリズムで収縮し始めます2,3。驚くべきことに、個々のhiPSC-CMは互いに結合し、単一の組織として拍動する機能的合胞体を形成します。現在、hiPS細胞は日常的に患者の血液サンプルに由来するため、in vitro hiPSC-CM心毒性スクリーニングアッセイを使用して、あらゆる人を表すことができます4,5。これにより、「皿の中の臨床試験」を実施する機会が生まれ、多様な集団からの重要な代表がいます6。
既存の動物および動物細胞の心毒性スクリーニングアプローチに対する重要な利点の1つは、hiPSC-CMが完全なヒトゲノムを利用し、ヒト心臓と遺伝的に類似したin vitroシステムを提供することです。これは、薬理ゲノミクスや個別化医療にとって特に魅力的であり、薬物療法やその他の治療法の開発にhiPSC-CMを使用することで、より正確で正確かつ安全な投薬処方が可能になると予測されています。実際、2次元(2D)hiPSC-CM単層アッセイは、不整脈を引き起こすリスクが知られている臨床的に使用される薬物のパネルを使用して、薬物の心毒性を予測することが証明されています1、7、8、9。hiPSC-CMの大きな可能性と、医薬品開発を合理化し、より安価にすることを約束しているにもかかわらず、これらの新しいアッセイを使用することには消極的でした10、11、12。
これまで、hiPSC-CMスクリーニングアッセイの広範な採用と受け入れの大きな制限の1つは、未熟な胎児のような外観とその機能でした。hiPSC-CM成熟の重要な問題は、科学文献アドナウセウム13,14,15,16でレビューされ、議論されています。同様に、2D単層での細胞外マトリックス(ECM)操作や3D操作心臓組織(EHT)の開発など、hiPSC-CMの成熟を促進するために多くのアプローチが採用されてきました17,18。現時点では、3D EHTの使用は、2D単層ベースのアプローチと比較して優れた成熟度を提供すると広く信じられています。ただし、2D単分子膜は、3D EHTと比較して、セル利用の効率が高く、めっきの成功率が向上します。3D EHTはより多くの細胞を利用し、多くの場合、結果を混乱させる可能性のある他の細胞タイプを含める必要があります。そこで本稿では、電気的・機械的結合細胞の2次元単層として培養したhiPSC-CMを簡便な方法で成熟させることに焦点をあてます。
高度なhiPSC-CM成熟は、ECMを使用して2D単層で達成できます。hiPSC-CMの2D単分子膜は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞(マウスECM)によって分泌される基底膜マトリックスでコーティングされた、柔らかく柔軟なポリジメチルシロキサンカバーガラスを使用して成熟させることができます。2016年には、このソフトECM条件で培養したhiPSC-CMが機能的に成熟し、成人の心臓値(~50 cm/s)に近い活動電位伝導速度を示すことが報告されました18。さらに、これらの成熟したhiPSC-CMは、過分極休止膜電位やKir2.1の発現など、成人の心臓を連想させる他の多くの電気生理学的特性を示しました。最近では、2D hiPSC-CMの構造的成熟を促進するヒト周産期幹細胞由来のECMコーティングが同定されたという報告があります19。ここでは、ハイスループット電気生理学的スクリーニングで使用するために、構造的に成熟した2D hiPSC-CM単分子膜に使いやすい方法を紹介します。さらに、電位感受性色素(VSD)とカルシウム感受性プローブおよびタンパク質を使用して、2D hiPSC-CM単層電気生理学的機能の自動取得と分析のための光学マッピング装置の検証を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
hiPSC-CMを用いた in vitro 心毒性スクリーニングには、いくつかの異なるアプローチがあります。hiPSC-CMの使用に関する最近の「ベストプラクティス」論文では、さまざまな in vitro アッセイ、それらの主要な読み出し、そして重要なことに、ヒトの心臓電気生理学的機能を定量化するための各アッセイの粒度が提示されました20。メンブレンピアス電極の使用に加?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH助成金HL148068-04およびR44ES027703-02(TJH)によってサポートされています。
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
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