使用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层进行高通量心脏毒性筛选
Summary
人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为使用动物进行临床前心脏毒性筛查提供了一种替代方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛查中广泛采用的一个限制是细胞的不成熟，胎儿样表型。这里介绍的是用于hiPSC-CMs稳健和快速成熟的方案。
Abstract
人诱导干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）用于替代和减少对动物和动物细胞的依赖，以进行临床前心脏毒性测试。在二维单层形式中，hiPSC-CMs概括了在最佳细胞外基质（ECM）上培养的成人心肌细胞的结构和功能。人围产期干细胞衍生的ECM（成熟诱导细胞外基质-MECM）在铺板后7天内使hiPSC-CM结构、功能和代谢状态成熟。
成熟的hiPSC-CM单层对临床相关药物也有预期的反应，已知有引起心律失常和心脏毒性的风险。到目前为止，hiPSC-CM单层的成熟是这些有价值的细胞广泛用于监管科学和安全筛选的障碍。本文介绍了用于hiPSC-CM电生理和收缩功能的电镀、成熟和高通量功能表型的验证方法。这些方法适用于市售纯化的心肌细胞，以及使用高效的腔室特异性分化方案在内部生成的干细胞来源的心肌细胞。
使用电压敏感染料 （VSD;发射波长：488 nm）、钙敏感荧光团 （CSF） 或基因编码钙传感器 （GCaMP6） 测量高通量电生理功能。高通量光学映射设备用于每个功能参数的光学记录，并使用定制的专用软件进行电生理数据分析。MECM方案用于使用正性肌力药物（异丙肾上腺素）和人乙醚相关基因（hERG）通道特异性阻断剂进行药物筛查。这些资源将使其他研究人员能够成功地利用成熟的hiPSC-CMs进行高通量，临床前心脏毒性筛查，心脏药物疗效测试和心血管研究。
Introduction
人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已在国际范围内得到验证，可用于体外心脏毒性筛查1。高纯度的hiPSC-CMs可以产生几乎无限的数量，冷冻保存和解冻。重新镀层后，它们也会复活并开始以让人联想到人类心脏的节奏收缩2，3。值得注意的是，单个hiPSC-CMs相互偶联并形成功能性合胞体，作为单个组织跳动。如今，hiPSCs通常来自患者的血液样本，因此任何人都可以使用体外hiPSC-CM心脏毒性筛查测定4，5来代表。这为进行“培养皿中的临床试验”创造了机会，来自不同人群的重要代表性6.
与现有的动物和动物细胞心脏毒性筛选方法相比，一个关键优势是hiPSC-CMs利用完整的人类基因组，并提供与人类心脏具有遗传相似性的体外系统。这对于药物基因组学和个性化医疗特别有吸引力 – 使用hiPSC-CMs进行药物和其他治疗开发预计将提供更准确，精确和安全的药物处方。事实上，二维（2D）hiPSC-CM单层测定已被证明可以预测药物的心脏毒性，使用一组临床使用的药物，已知有引起心律失常的风险1，7，8，9。尽管hiPSC-CMs具有巨大的潜力，并且有望简化和降低药物开发成本，但人们一直不愿意使用这些新型检测方法10，11，12。
到目前为止，广泛采用和接受hiPSC-CM筛查测定的一个主要限制是它们不成熟的胎儿外观以及它们的功能。hiPSC-CM成熟的关键问题已经在科学文献中进行了回顾和辩论，并进行了恶心13，14，15，16。同样，已经采用了许多方法来促进hiPSC-CM成熟，包括2D单层中的细胞外基质（ECM）操作和3D工程心脏组织（EHT）的开发17，18。目前，人们普遍认为，相对于基于2D单层的方法，使用3D EHT将提供更高的成熟度。然而，与 3D EHT 相比，2D 单层提供了更高的细胞利用效率，并提高了电镀成功率;3D EHT利用更多的细胞，并且通常需要包含可能混淆结果的其他细胞类型。因此，在本文中，重点是使用一种简单的方法来成熟培养为电和机械耦合细胞的2D单层的hiPSC-CMs。
先进的hiPSC-CM成熟可以使用ECM在2D单层中实现。hiPSC-CMs的2D单层可以使用柔软，灵活的聚二甲基硅氧烷盖玻片成熟，该盖玻片涂有由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞（小鼠ECM）分泌的基底膜基质。2016年，报告显示，在这种软ECM条件下培养的hiPSC-CMs在功能上成熟，显示出接近成人心脏值（~50 cm / s）的动作电位传导速度18。此外，这些成熟的hiPSC-CMs显示出许多其他让人联想到成人心脏的电生理特征，包括超极化静息膜电位和K ir2.1的表达。最近，报告发现了一种人类围产期干细胞衍生的ECM涂层，可促进2D hiPSC-CMs19的结构成熟。在这里，提出了结构成熟的2D hiPSC-CM单层的易于使用的方法，用于高通量电生理筛选。此外，我们还使用电压敏感染料（VSD）和钙敏感探针和蛋白质，提供用于自动采集和分析2D hiPSC-CM单层电生理功能的光学映射仪器的验证。
Protocol
Representative Results
Discussion
有几种不同的方法可以使用hiPSC-CMs进行 体外 心脏毒性筛查。最近一篇关于使用 hiPSC-CMs 的“最佳实践”论文介绍了各种 体外 测定、其主要读数，以及重要的是，每种测定的粒度以量化人类心脏电生理功能20。除了使用穿膜电极外，VSDs还提供了人类心脏电生理功能的最直接测量。 VSD检测读数能够直接可视化和量化关键电生理参数，包括动作电位持续时间、动作电位…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH拨款HL148068-04和R44ES027703-02（TJH）的支持。
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
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