Kardiotoksicitetsscreening med høj kapacitet ved hjælp af modne humane inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytmonolag
Summary
Human induceret pluripotent stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) tilbyder et alternativ til at bruge dyr til præklinisk kardiotoksicitetsscreening. En begrænsning for den udbredte anvendelse af hiPSC-CM’er i præklinisk toksicitetsscreening er cellernes umodne, føtallignende fænotype. Her præsenteres protokoller for robust og hurtig modning af hiPSC-CM’er.
Abstract
Human inducerede stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) anvendes til at erstatte og reducere afhængigheden af dyr og dyreceller til præklinisk kardiotoksicitetstestning. I todimensionelle monolagsformater rekapitulerer hiPSC-CM’er strukturen og funktionen af de voksne menneskelige hjertemuskelceller, når de dyrkes på en optimal ekstracellulær matrix (ECM). En human perinatal stamcelleafledt ECM (modningsinducerende ekstracellulær matrix-MECM) modner hiPSC-CM-strukturen, funktionen og metabolisk tilstand på 7 dage efter plettering.
Modne hiPSC-CM-monolag reagerer også som forventet på klinisk relevante lægemidler med en kendt risiko for at forårsage arytmier og kardiotoksicitet. Modningen af hiPSC-CM-monolag var en hindring for den udbredte anvendelse af disse værdifulde celler til lovgivningsmæssig videnskab og sikkerhedsscreening indtil nu. Denne artikel præsenterer validerede metoder til plettering, modning og funktionel fænotypning med høj kapacitet af hiPSC-CM elektrofysiologisk og kontraktil funktion. Disse metoder gælder for kommercielt tilgængelige oprensede kardiomyocytter samt stamcelleafledte kardiomyocytter, der genereres internt ved hjælp af meget effektive, kammerspecifikke differentieringsprotokoller.
Elektrofysiologisk funktion med høj kapacitet måles ved hjælp af enten spændingsfølsomme farvestoffer (VSD’er; emission: 488 nm), calciumfølsomme fluoroforer (CSF’er) eller genetisk kodede calciumsensorer (GCaMP6). En optisk kortlægningsenhed med høj kapacitet bruges til optiske optagelser af hver funktionel parameter, og brugerdefineret dedikeret software bruges til elektrofysiologisk dataanalyse. MECM-protokoller anvendes til medicinscreening ved hjælp af en positiv inotrop (isoprenalin) og human Ether-a-go-go-related gene (hERG) kanalspecifikke blokkere. Disse ressourcer vil gøre det muligt for andre efterforskere med succes at udnytte modne hiPSC-CM’er til screening med høj gennemstrømning, præklinisk kardiotoksicitet, hjertemedicineffektivitetstest og kardiovaskulær forskning.
Introduction
Human induceret pluripotent stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) er blevet valideret på internationalt plan og er tilgængelige til in vitro kardiotoksicitetsscreening1. Meget rene hiPSC-CM’er kan genereres i næsten ubegrænset antal, kryopræserveres og optøes. Efter genplettering genoplives de også og begynder at trække sig sammen med en rytme, der minder om det menneskelige hjerte 2,3. Bemærkelsesværdigt parrer individuelle hiPSC-CM’er sig til hinanden og danner funktionel syncytia, der slår som et enkelt væv. I dag er hiPSC’er rutinemæssigt afledt af patientens blodprøver, så enhver person kan repræsenteres ved hjælp af in vitro hiPSC-CM kardiotoksicitetsscreeningsassays 4,5. Dette skaber mulighed for at udføre “kliniske forsøg i en skål” med betydelig repræsentation fra forskellige populationer6.
En kritisk fordel i forhold til eksisterende dyre- og dyrecellekardiotoksicitetsscreeningsmetoder er, at hiPSC-CM’er udnytter det fulde humane genom og tilbyder et in vitro-system med genetiske ligheder med det menneskelige hjerte. Dette er især attraktivt for farmakogenomik og personlig medicin – brugen af hiPSC-CM’er til medicin og anden terapiudvikling forventes at give mere nøjagtige, præcise og sikre medicinrecepter. Faktisk har todimensionelle (2D) hiPSC-CM monolagsanalyser vist sig at være prædiktive for medicinsk kardiotoksicitet ved hjælp af et panel af klinisk anvendte lægemidler med en kendt risiko for at forårsage arytmier 1,7,8,9. På trods af det enorme potentiale i hiPSC-CM’er og løftet om at strømline og gøre lægemiddeludvikling billigere, har der været en modvilje mod at bruge disse nye assays10,11,12.
Indtil nu er en væsentlig begrænsning af udbredt vedtagelse og accept af hiPSC-CM-screeningsassays deres umodne, fosterlignende udseende såvel som deres funktion. Det kritiske spørgsmål om hiPSC-CM-modning er blevet gennemgået og debatteret i den videnskabelige litteratur ad nauseum13,14,15,16. Ligeledes er der anvendt mange tilgange til at fremme hiPSC-CM-modning, herunder ekstracellulær matrix (ECM) manipulationer i 2D-monolag og udvikling af 3D-manipulerede hjertevæv (EHT’er)17,18. I øjeblikket er der en udbredt tro på, at brugen af 3D EHT’er vil give overlegen modning i forhold til 2D-monolagsbaserede tilgange. Imidlertid giver 2D-monolag en højere effektivitet af celleudnyttelse og øget succes med plettering sammenlignet med 3D EHT’er; 3D EHT’er bruger et større antal celler og kræver ofte inkludering af andre celletyper, der kan forvirre resultaterne. Derfor er fokus i denne artikel på at bruge en simpel metode til at modne hiPSC-CM’er dyrket som 2D-monolag af elektrisk og mekanisk koblede celler.
Avanceret hiPSC-CM-modning kan opnås i 2D-monolag ved hjælp af en ECM. 2D-monolagene af hiPSC-CM’er kan modnes ved hjælp af en blød, fleksibel polydimethylsiloxan-coverslip, belagt med kældermembranmatrix udskilt af en Engelbreth-Holm-Swarm-musesarkomcelle (muse-ECM). I 2016 viste rapporter, at hiPSC-CM’er dyrket på denne bløde ECM-tilstand modnes funktionelt og viser aktionspotentielle ledningshastigheder nær voksne hjerteværdier (~ 50 cm / s)18. Desuden viste disse modne hiPSC-CM’er mange andre elektrofysiologiske egenskaber, der minder om det voksne hjerte, herunder hyperpolariseret hvilemembranpotentiale og ekspression af Kir2.1. For nylig identificerede rapporter en human perinatal stamcelleafledt ECM-belægning, der fremmer strukturel modning af 2D hiPSC-CM’er19. Her præsenteres brugervenlige metoder til strukturelt modne 2D hiPSC-CM-monolag til brug i elektrofysiologiske skærme med høj kapacitet. Desuden leverer vi validering af et optisk kortlægningsinstrument til automatiseret erhvervelse og analyse af 2D hiPSC-CM monolags elektrofysiologisk funktion ved hjælp af spændingsfølsomme farvestoffer (VSD’er) og calciumfølsomme sonder og proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere forskellige tilgange til in vitro kardiotoksicitet screening ved hjælp af hiPSC-CMs. Et nyligt “Best Practices” -papir om brugen af hiPSC-CM’er præsenterede de forskellige in vitro-assays , deres primære aflæsninger og vigtigst af alt hvert assays granularitet til kvantificering af human hjerteelektrofysiologisk funktion20. Ud over at bruge membranpiercingelektroder tilvejebringes det mest direkte mål for menneskelig hjerteelektrofysiologisk funktion af VSD’er. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er blevet støttet af NIH-tilskud HL148068-04 og R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova, ., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
