Hochdurchsatz-Kardiotoxizitäts-Screening unter Verwendung von reifen, humaninduzierten pluripotenten Stammzell-Kardiomyozyten-Monoschichten
Summary
Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) bieten eine Alternative zur Verwendung von Tieren für das präklinische Kardiotoxizitäts-Screening. Eine Einschränkung für die weit verbreitete Einführung von hiPSC-CMs im präklinischen Toxizitätsscreening ist der unreife, fetale Phänotyp der Zellen. Hier werden Protokolle für eine robuste und schnelle Reifung von hiPSC-CMs vorgestellt.
Abstract
Aus humanen Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) werden verwendet, um die Abhängigkeit von Tieren und tierischen Zellen für präklinische Kardiotoxizitätstests zu ersetzen und zu verringern. In zweidimensionalen Monolayer-Formaten rekapitulieren hiPSC-CMs die Struktur und Funktion der adulten menschlichen Herzmuskelzellen, wenn sie auf einer optimalen extrazellulären Matrix (EZM) kultiviert werden. Eine aus humanen perinatalen Stammzellen gewonnene EZM (Maturation-inducing extracellular matrix-MECM) reift die hiPSC-CM-Struktur, -Funktion und den Stoffwechselzustand innerhalb von 7 Tagen nach der Plattierung.
Reife hiPSC-CM-Monoschichten sprechen auch auf klinisch relevante Medikamente erwartungsgemäß an, wobei ein bekanntes Risiko besteht, Herzrhythmusstörungen und Kardiotoxizität zu verursachen. Die Reifung von hiPSC-CM-Monoschichten war bisher ein Hindernis für die breite Akzeptanz dieser wertvollen Zellen für die regulatorische Wissenschaft und das Sicherheitsscreening. In diesem Artikel werden validierte Methoden für das Platting, die Reifung und die funktionelle Phänotypisierung der elektrophysiologischen und kontraktilen Funktion von hiPSC-CM vorgestellt. Diese Methoden gelten sowohl für kommerziell erhältliche gereinigte Kardiomyozyten als auch für aus Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten, die intern mit hocheffizienten, kammerspezifischen Differenzierungsprotokollen erzeugt werden.
Die elektrophysiologische Funktion im Hochdurchsatz wird entweder mit spannungsempfindlichen Farbstoffen (VSDs; Emission: 488 nm), kalziumempfindlichen Fluorophoren (CSFs) oder genetisch kodierten Kalziumsensoren (GCaMP6) gemessen. Ein optisches Hochdurchsatz-Kartierungsgerät wird für die optische Aufzeichnung jedes Funktionsparameters verwendet, und eine spezielle Software wird für die elektrophysiologische Datenanalyse verwendet. MECM-Protokolle werden für das Medikationsscreening unter Verwendung eines positiven inotropen (Isoprenalin) und humanen Ether-a-go-go-related gene (hERG)-Kanal-spezifischen Blockers angewendet. Diese Ressourcen werden es anderen Prüfärzten ermöglichen, ausgereifte hiPSC-CMs erfolgreich für Hochdurchsatz, präklinisches Kardiotoxizitätsscreening, Wirksamkeitstests von Herzmedikamenten und kardiovaskuläre Forschung einzusetzen.
Introduction
Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) wurden auf internationaler Ebene validiert und stehen für ein In-vitro-Kardiotoxizitäts-Screening zur Verfügung 1. Hochreine hiPSC-CMs können in nahezu unbegrenzter Anzahl erzeugt, kryokonserviert und aufgetaut werden. Nach dem Umplattieren reanimieren sie sich ebenfalls und beginnen sich mit einem Rhythmus zusammenzuziehen, der an das menschliche Herz erinnert 2,3. Bemerkenswert ist, dass einzelne hiPSC-CMs aneinander koppeln und funktionelle Synzytien bilden, die als ein einziges Gewebe schlagen. Heutzutage werden hiPS-Zellen routinemäßig aus Blutproben von Patienten gewonnen, so dass jede Person mit In-vitro-hiPSC-CM-Screening-Assays für die Kardiotoxizität dargestellt werden kann 4,5. Dies schafft die Möglichkeit, “klinische Studien in einer Schale” durchzuführen, bei denen verschiedene Populationen signifikant vertreten sind6.
Ein entscheidender Vorteil gegenüber bestehenden Screening-Ansätzen für die Kardiotoxizität von Tieren und tierischen Zellen besteht darin, dass hiPSC-CMs das gesamte menschliche Genom nutzen und ein In-vitro-System mit genetischen Ähnlichkeiten zum menschlichen Herzen bieten. Dies ist besonders attraktiv für die Pharmakogenomik und die personalisierte Medizin – die Verwendung von hiPSC-CMs für die Entwicklung von Medikamenten und anderen Therapien soll genauere, präzisere und sicherere Medikamentenverschreibungen ermöglichen. In der Tat haben sich zweidimensionale (2D) hiPSC-CM-Monolayer-Assays als prädiktiv für die Kardiotoxizität von Medikamenten erwiesen, wobei eine Reihe von klinisch eingesetzten Medikamenten mit einem bekannten Risiko für die Entstehung von Herzrhythmusstörungen verwendetwird 1,7,8,9. Trotz des enormen Potenzials von hiPSC-CMs und des Versprechens, die Arzneimittelentwicklung zu rationalisieren und billiger zu machen, gab es eine Zurückhaltung bei der Verwendung dieser neuartigen Assays10,11,12.
Bisher ist eine wesentliche Einschränkung der weit verbreiteten Einführung und Akzeptanz von hiPSC-CM-Screening-Assays ihr unreifes, fetales Aussehen sowie ihre Funktion. Die kritische Frage der hiPSC-CM-Reifung wurde in der wissenschaftlichen Literatur bis zum Überdruss diskutiert 13,14,15,16. Ebenso wurden viele Ansätze eingesetzt, um die hiPSC-CM-Reifung zu fördern, darunter Manipulationen der extrazellulären Matrix (EZM) in 2D-Monoschichten und die Entwicklung von 3D-manipuliertem Herzgewebe (EHTs)17,18. Derzeit herrscht die weit verbreitete Überzeugung, dass die Verwendung von 3D-EHTs im Vergleich zu 2D-Monolayer-basierten Ansätzen eine bessere Reifung bieten wird. 2D-Monolagen bieten jedoch im Vergleich zu 3D-EHTs eine höhere Effizienz der Zellnutzung und einen höheren Erfolg bei der Beschichtung. 3D-EHTs verwenden eine größere Anzahl von Zellen und erfordern oft die Einbeziehung anderer Zelltypen, die die Ergebnisse verfälschen können. Daher liegt der Fokus in diesem Artikel auf der Verwendung einer einfachen Methode zur Reifung von hiPSC-CMs, die als 2D-Monolagen aus elektrisch und mechanisch gekoppelten Zellen kultiviert werden.
Eine fortgeschrittene hiPSC-CM-Reifung kann in 2D-Monolagen mit einem ECM erreicht werden. Die 2D-Monoschichten von hiPSC-CMs können mit Hilfe eines weichen, flexiblen Polydimethylsiloxan-Deckglases gereift werden, das mit einer Basalmembranmatrix beschichtet ist, die von einer Engelbreth-Holm-Schwarm-Maussarkomzelle (Maus-EZM) sezerniert wird. Im Jahr 2016 zeigten Berichte, dass hiPSC-CMs, die unter dieser weichen EZM-Erkrankung kultiviert wurden, funktionell reiften und Aktionspotential-Leitungsgeschwindigkeiten in der Nähe von Herzwerten bei Erwachsenen (~50 cm/s) aufwiesen18. Darüber hinaus zeigten diese reifen hiPSC-CMs viele andere elektrophysiologische Eigenschaften, die an das adulte Herz erinnern, einschließlich des hyperpolarisierten Ruhemembranpotentials und der Expression von Kir2.1. In jüngerer Zeit wurde in Berichten eine aus humanen perinatalen Stammzellen gewonnene EZM-Beschichtung identifiziert, die die strukturelle Reifung von 2D-hiPSC-CMs fördert19. Hier werden einfach anzuwendende Methoden vorgestellt, um strukturell ausgereifte 2D-hiPSC-CM-Monolagen für den Einsatz in elektrophysiologischen Hochdurchsatz-Screens zu entwickeln. Darüber hinaus bieten wir die Validierung eines optischen Mapping-Instruments für die automatisierte Erfassung und Analyse der elektrophysiologischen Funktion von 2D-hiPSC-CM-Monolayern unter Verwendung spannungsempfindlicher Farbstoffe (VSDs) und kalziumsensitiver Sonden und Proteine an.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt verschiedene Ansätze für das In-vitro-Kardiotoxizitätsscreening mit hiPSC-CMs . In einem kürzlich veröffentlichten “Best Practices”-Artikel über die Verwendung von hiPSC-CMs wurden die verschiedenen In-vitro-Assays , ihre primären Messwerte und vor allem die Granularität jedes Assays zur Quantifizierung der elektrophysiologischen Funktion des menschlichen Herzensvorgestellt 20. Neben der Verwendung von Membran-Piercing-Elektroden liefern VSDs das direkteste Maß f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse HL148068-04 und R44ES027703-02 (TJH) unterstützt.
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
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