परिपक्व मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट मोनोलेयर का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग
Summary
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) प्रीक्लिनिकल कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग के लिए जानवरों का उपयोग करने का विकल्प प्रदान करते हैं। प्रीक्लिनिकल विषाक्तता स्क्रीनिंग में एचआईपीएससी-सीएम को व्यापक रूप से अपनाने की एक सीमा कोशिकाओं के अपरिपक्व, भ्रूण जैसे फेनोटाइप है। यहां प्रस्तुत एचआईपीएससी-सीएम की मजबूत और तेजी से परिपक्वता के लिए प्रोटोकॉल हैं।
Abstract
मानव प्रेरित स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) का उपयोग प्रीक्लिनिकल कार्डियोटॉक्सिसिटी परीक्षण के लिए जानवरों और पशु कोशिकाओं पर निर्भरता को बदलने और कम करने के लिए किया जाता है। दो-आयामी मोनोलेयर प्रारूपों में, HIPSC-CMs एक इष्टतम बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) पर सुसंस्कृत होने पर वयस्क मानव हृदय की मांसपेशियों की कोशिकाओं की संरचना और कार्य को पुन: परिभाषित करते हैं। एक मानव प्रसवकालीन स्टेम सेल-व्युत्पन्न ईसीएम (परिपक्वता-उत्प्रेरण बाह्य मैट्रिक्स-एमईसीएम) चढ़ाना के बाद 7 दिनों में एचआईपीएससी-सीएम संरचना, कार्य और चयापचय अवस्था को परिपक्व करता है।
परिपक्व HIPSC-CM मोनोलेयर भी चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक दवाओं की अपेक्षा के अनुसार प्रतिक्रिया करते हैं, जिसमें अतालता और कार्डियोटॉक्सिसिटी पैदा करने का ज्ञात जोखिम होता है। एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर की परिपक्वता अब तक नियामक विज्ञान और सुरक्षा स्क्रीनिंग के लिए इन मूल्यवान कोशिकाओं को व्यापक रूप से अपनाने में एक बाधा थी। यह लेख हाइपीएससी-सीएम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन के प्लेटिंग, परिपक्वता और उच्च-थ्रूपुट, कार्यात्मक फेनोटाइपिंग के लिए मान्य तरीके प्रस्तुत करता है। ये विधियां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध कार्डियोमायोसाइट्स, साथ ही अत्यधिक कुशल, कक्ष-विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके घर में उत्पन्न स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स पर लागू होती हैं।
उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फ़ंक्शन को वोल्टेज-संवेदनशील रंजक (वीएसडी; उत्सर्जन: 488 एनएम), कैल्शियम-संवेदनशील फ्लोरोफोरेस (सीएसएफ), या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर (जीसीएएमपी 6) का उपयोग करके मापा जाता है। प्रत्येक कार्यात्मक पैरामीटर की ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट ऑप्टिकल मैपिंग डिवाइस का उपयोग किया जाता है, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा विश्लेषण के लिए कस्टम समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है। एमईसीएम प्रोटोकॉल को सकारात्मक इनोट्रोप (आइसोप्रेनालाइन) और मानव ईथर-ए-गो-गो-संबंधित जीन (एचईआरजी) चैनल-विशिष्ट ब्लॉकर्स का उपयोग करके दवा स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जाता है। ये संसाधन अन्य जांचकर्ताओं को उच्च-थ्रूपुट, प्रीक्लिनिकल कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग, कार्डियक दवा प्रभावकारिता परीक्षण और कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान के लिए परिपक्व एचआईपीएससी-सीएम का सफलतापूर्वक उपयोग करने में सक्षम बनाएंगे।
Introduction
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) को अंतरराष्ट्रीय स्तर पर मान्य किया गया है, और इन विट्रो कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग1 के लिए उपलब्ध हैं। अत्यधिक शुद्ध HIPSC-CM को लगभग असीमित संख्या में उत्पन्न किया जा सकता है, क्रायोसंरक्षित और पिघलाया जा सकता है। पुनरावृत्ति करने पर, वे भी पुनर्जीवित होते हैं और मानव हृदय2,3 की याद दिलाने वाली लय के साथ अनुबंध करना शुरू कर देते हैं। उल्लेखनीय रूप से, व्यक्तिगत HIPSC-CM एक-दूसरे से जुड़ते हैं और कार्यात्मक सिंकिटिया बनाते हैं जो एकल ऊतक के रूप में धड़कते हैं। आजकल, एचआईपीएससी नियमित रूप से रोगी के रक्त के नमूनों से प्राप्त किए जाते हैं, इसलिए किसी भी व्यक्ति को इन विट्रो एचआईपीएससी-सीएम कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंगपरख 4,5 का उपयोग करके दर्शाया जा सकता है। यह विभिन्न आबादी से महत्वपूर्ण प्रतिनिधित्व के साथ “एक डिश में नैदानिक परीक्षण” करने का अवसर बनाताहै।
मौजूदा पशु और पशु सेल कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग दृष्टिकोणों पर एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि HIPSC-CMS पूर्ण मानव जीनोम का उपयोग करते हैं और मानव हृदय के लिए आनुवंशिक समानता के साथ एक इन विट्रो सिस्टम प्रदान करते हैं। यह फार्माकोजेनोमिक्स और व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए विशेष रूप से आकर्षक है – दवा और अन्य चिकित्सा विकास के लिए एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग अधिक सटीक, सटीक और सुरक्षित दवा नुस्खे प्रदान करने के लिए भविष्यवाणी की गई है। दरअसल, दो-आयामी (2 डी) एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर परख दवा कार्डियोटॉक्सिसिटी का पूर्वानुमान साबित हुआ है, चिकित्सकीय रूप से उपयोग की जाने वाली दवाओं के एक पैनल का उपयोग करके अतालता 1,7,8,9 पैदा करने का ज्ञात जोखिम है। एचआईपीएससी-सीएम की विशाल क्षमता और दवा विकास को सुव्यवस्थित और सस्ता बनाने के वादे के बावजूद, इन नए परीक्षणों का उपयोग करने में अनिच्छा रही है।
अब तक, एचआईपीएससी-सीएम स्क्रीनिंग परख को व्यापक रूप से अपनाने और स्वीकृति की एक बड़ी सीमा उनकी अपरिपक्व, भ्रूण जैसी उपस्थिति, साथ ही साथ उनका कार्य है। HIPSC-CM परिपक्वता के महत्वपूर्ण मुद्दे की समीक्षा की गई है और वैज्ञानिक साहित्य ad nauseum 13,14,15,16 में बहस की गई है। इसी तरह, एचआईपीएससी-सीएम परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए कई दृष्टिकोणों को नियोजित किया गया है, जिसमें 2 डी मोनोलेयर में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) जोड़तोड़ और 3 डी इंजीनियर हृदय ऊतकों (ईएचटी) 17,18 का विकास शामिल है। फिलहाल, एक व्यापक रूप से आयोजित धारणा है कि 3 डी ईएचटी का उपयोग 2 डी मोनोलेयर-आधारित दृष्टिकोणों के सापेक्ष बेहतर परिपक्वता प्रदान करेगा। हालांकि, 2 डी मोनोलेयर सेल उपयोग की उच्च दक्षता प्रदान करते हैं और 3 डी ईएचटी की तुलना में चढ़ाना में सफलता में वृद्धि करते हैं; 3 डी ईएचटी अधिक संख्या में कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, और अक्सर अन्य सेल प्रकारों को शामिल करने की आवश्यकता होती है जो परिणामों को भ्रमित कर सकते हैं। इसलिए, इस लेख में, विद्युत और यांत्रिक रूप से युग्मित कोशिकाओं के 2 डी मोनोलेयर के रूप में संवर्धित एचआईपीएससी-सीएम को परिपक्व करने के लिए एक सरल विधि का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया गया है।
उन्नत HIPSC-CM परिपक्वता एक ईसीएम का उपयोग करके 2 डी मोनोलेयर में प्राप्त की जा सकती है। HIPSC-CM के 2D मोनोलेयर को एक नरम, लचीले पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन कवरस्लिप का उपयोग करके परिपक्व किया जा सकता है, जो एक एंगेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म माउस सारकोमा सेल (माउस ईसीएम) द्वारा स्रावित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित होता है। 2016 में, रिपोर्टों से पता चला कि इस नरम ईसीएम स्थिति पर संवर्धित HIPSC-CM कार्यात्मक रूप से परिपक्व हुए, वयस्क हृदय मूल्यों (~ 50 सेमी / s) 18 के पास कार्रवाई संभावित चालन वेग प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, इन परिपक्व HIPSC-CMs ने वयस्क हृदय की याद दिलाने वाली कई अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं को प्रदर्शित किया, जिसमें हाइपरपोलराइज्ड रेस्टिंग मेम्ब्रेन क्षमता औरKir2.1 की अभिव्यक्ति शामिल है। हाल ही में, रिपोर्टों ने एक मानव प्रसवकालीन स्टेम सेल-व्युत्पन्न ईसीएम कोटिंग की पहचान की जो 2 डी एचआईपीएससी-सीएम19 की संरचनात्मक परिपक्वता को बढ़ावा देती है। यहां, उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल स्क्रीन में उपयोग के लिए संरचनात्मक रूप से परिपक्व 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर के लिए उपयोग में आसान तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। इसके अलावा, हम वोल्टेज-संवेदनशील रंजक (वीएसडी) और कैल्शियम-संवेदनशील जांच और प्रोटीन का उपयोग करके 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फ़ंक्शन के स्वचालित अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए एक ऑप्टिकल मैपिंग उपकरण का सत्यापन प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग करके इन विट्रो कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोण हैं। एचआईपीएससी-सीएम के उपयोग पर हाल ही में “सर्वोत्तम अभ्यास” पेपर ने विभिन्न इन विट्रो परखो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच अनुदान एचएल 148068-04 और आर 44ईएस027703-02 (टीजेएच) द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
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