Высокопроизводительный скрининг кардиотоксичности с использованием зрелых монослоев кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека
Summary
Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), предлагают альтернативу использованию животных для доклинического скрининга кардиотоксичности. Ограничением для широкого внедрения hiPSC-CM в доклиническом скрининге токсичности является незрелый, эмбрионоподобный фенотип клеток. Здесь представлены протоколы для надежного и быстрого созревания hiPSC-CM.
Abstract
Кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC-CM), используются для замены и снижения зависимости от животных и клеток животных для доклинических испытаний на кардиотоксичность. В двумерных монослойных форматах hiPSC-CM повторяют структуру и функцию клеток сердечной мышцы взрослого человека при культивировании на оптимальном внеклеточном матриксе (ECM). ECM, полученный из перинатальных стволовых клеток человека (индуцирующий созревание внеклеточный матрикс-MECM-MECM), созревает структуру, функцию и метаболическое состояние hiPSC-CM через 7 дней после нанесения покрытия.
Зрелые монослои hiPSC-CM также реагируют, как и ожидалось, на клинически значимые лекарства с известным риском возникновения аритмий и кардиотоксичности. Созревание монослоев hiPSC-CM до сих пор было препятствием для широкого внедрения этих ценных клеток для нормативной науки и скрининга безопасности. В этой статье представлены валидированные методы нанесения покрытия, созревания и высокопроизводительного функционального фенотипирования электрофизиологической и сократительной функции hiPSC-CM. Эти методы применимы к коммерчески доступным очищенным кардиомиоцитам, а также к кардиомиоцитам, полученным из стволовых клеток, полученным собственными силами с использованием высокоэффективных протоколов камерно-специфической дифференцировки.
Высокопроизводительная электрофизиологическая функция измеряется с помощью чувствительных к напряжению красителей (VSD; излучение: 488 нм), кальций-чувствительных флуорофоров (CSF) или генетически кодируемых кальциевых датчиков (GCaMP6). Для оптической записи каждого функционального параметра используется высокопроизводительное оптическое картографическое устройство, а для анализа электрофизиологических данных используется специальное программное обеспечение. Протоколы MECM применяются для скрининга лекарств с использованием положительного инотропа (изопреналин) и блокаторов канала, связанных с эфиром (hERG) человека. Эти ресурсы позволят другим исследователям успешно использовать зрелые hiPSC-CM для высокопроизводительного доклинического скрининга кардиотоксичности, тестирования эффективности сердечных препаратов и сердечно-сосудистых исследований.
Introduction
Индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC-CM), были валидированы в международном масштабе и доступны дляскрининга кардиотоксичности in vitro1. Высокочистые hiPSC-CM могут генерироваться практически в неограниченном количестве, криоконсервироваться и размораживаться. После перекладывания они также реанимируются и начинают сокращаться с ритмом, напоминающим человеческое сердце 2,3. Примечательно, что отдельные hiPSC-CM соединяются друг с другом и образуют функциональные синцитии, которые бьются как единая ткань. В настоящее время ИПСК обычно получают из образцов крови пациентов, поэтому любой человек может быть представлен с помощью скрининговых анализов кардиотоксичности hiPSC-CM in vitro 4,5. Это создает возможность для проведения «клинических испытаний в блюде» со значительным представительством различных групп населения6.
Одним из важнейших преимуществ по сравнению с существующими подходами к скринингу кардиотоксичности клеток животных и животных является то, что hiPSC-CM используют полный геном человека и предлагают систему in vitro с генетическим сходством с человеческим сердцем. Это особенно привлекательно для фармакогеномики и персонализированной медицины – прогнозируется, что использование hiPSC-CM для разработки лекарств и других методов лечения обеспечит более точные, точные и безопасные назначения лекарств. Действительно, двумерные (2D) монослойные анализы hiPSC-CM доказали свою эффективность прогнозирования кардиотоксичности лекарств с использованием панели клинически используемых лекарств с известным риском возникновения аритмий 1,7,8,9. Несмотря на огромный потенциал hiPSC-CM и обещание упростить и удешевить разработку лекарств, существует нежелание использовать эти новые анализы10,11,12.
До сих пор одним из основных ограничений широкого внедрения и принятия скрининговых анализов hiPSC-CM является их незрелый, похожий на плод внешний вид, а также их функция. Критический вопрос созревания hiPSC-CM был рассмотрен и обсужден в научной литературе до тошноты13,14,15,16. Аналогичным образом, для стимулирования созревания hiPSC-CM было использовано множество подходов, включая манипуляции с внеклеточным матриксом (ECM) в 2D-монослоях и разработку 3D-инженерных тканей сердца (EHT)17,18. В настоящее время широко распространено мнение, что использование 3D EHT обеспечит превосходное созревание по сравнению с подходами на основе 2D монослоя. Однако 2D-монослои обеспечивают более высокую эффективность использования ячеек и больший успех в нанесении покрытия по сравнению с 3D-EHT; 3D EHT используют большее количество клеток и часто требуют включения других типов клеток, которые могут исказить результаты. Поэтому в этой статье основное внимание уделяется использованию простого метода созревания hiPSC-CM, культивируемых в виде 2D-монослоев электрически и механически связанных клеток.
Усовершенствованное созревание hiPSC-CM может быть достигнуто в 2D-монослоях с помощью ECM. 2D-монослои hiPSC-CM могут созревать с использованием мягкого, гибкого полидиметилсилоксанового покровного стекла, покрытого матриксом базальной мембраны, секретируемым клеткой саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (ECM мыши). В 2016 году отчеты показали, что hiPSC-CM, культивируемые в этом мягком состоянии ECM, функционально созревают, демонстрируя скорости проводимости потенциала действия вблизи значений сердца взрослого человека (~ 50 см / с)18. Кроме того, эти зрелые hiPSC-CM проявляли многие другие электрофизиологические характеристики, напоминающие сердце взрослого человека, включая гиперполяризованный мембранный потенциал покоя и экспрессию Kir2.1. Совсем недавно в отчетах было идентифицировано покрытие ECM, полученное из перинатальных стволовых клеток человека, которое способствует структурному созреванию 2D hiPSC-CMs19. Здесь представлены простые в использовании методы структурно зрелых 2D-монослоев hiPSC-CM для использования в высокопроизводительных электрофизиологических экранах. Кроме того, мы проводим валидацию оптического картографического прибора для автоматического сбора и анализа 2D монослойной электрофизиологической функции hiPSC-CM с использованием чувствительных к напряжению красителей (VSD) и чувствительных к кальцию зондов и белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько различных подходов к скринингу кардиотоксичности in vitro с использованием hiPSC-CM. В недавнем документе «Передовая практика» по использованию hiPSC-CM были представлены различные анализы in vitro , их первичные показания и, что важно, детализация каждого анализа для…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH HL148068-04 и R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova, ., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
