Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) erbjuder ett alternativ till att använda djur för preklinisk kardiotoxicitetsscreening. En begränsning för den utbredda användningen av hiPSC-CMs vid preklinisk toxicitetsscreening är cellernas omogna, fosterliknande fenotyp. Här presenteras protokoll för robust och snabb mognad av hiPSC-CM.
Humant inducerade stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) används för att ersätta och minska beroendet av djur och djurceller för preklinisk kardiotoxicitetstestning. I tvådimensionella monolagerformat rekapitulerar hiPSC-CMs strukturen och funktionen hos de vuxna mänskliga hjärtmuskelcellerna när de odlas på en optimal extracellulär matris (ECM). En human perinatal stamcellshärledd ECM (mognadsinducerande extracellulär matrix-MECM) mognar hiPSC-CM-strukturen, funktionen och det metaboliska tillståndet inom 7 dagar efter plätering.
Mogna hiPSC-CM-monolager svarar också som förväntat på kliniskt relevanta läkemedel, med en känd risk att orsaka arytmier och kardiotoxicitet. Mognaden av hiPSC-CM-monolager var ett hinder för den utbredda användningen av dessa värdefulla celler för regulatorisk vetenskap och säkerhetsscreening, tills nu. Denna artikel presenterar validerade metoder för plätering, mognad och funktionell fenotypning med hög genomströmning av hiPSC-CM elektrofysiologisk och kontraktil funktion. Dessa metoder gäller kommersiellt tillgängliga renade kardiomyocyter, såväl som stamcellshärledda kardiomyocyter som genereras internt med högeffektiva, kammarspecifika differentieringsprotokoll.
Elektrofysiologisk funktion med hög genomströmning mäts med antingen spänningskänsliga färgämnen (VSDs; emission: 488 nm), kalciumkänsliga fluoroforer (CSF) eller genetiskt kodade kalciumsensorer (GCaMP6). En optisk kartläggningsenhet med hög genomströmning används för optiska inspelningar av varje funktionell parameter, och anpassad dedikerad programvara används för elektrofysiologisk dataanalys. MECM-protokoll tillämpas för läkemedelsscreening med hjälp av en positiv inotrop (isoprenalin) och humana Ether-a-go-go-related gen (hERG) kanalspecifika blockerare. Dessa resurser kommer att göra det möjligt för andra utredare att framgångsrikt använda mogna hiPSC-CMs för hög genomströmning, preklinisk kardiotoxicitetsscreening, hjärtmedicineringseffektivitetstestning och kardiovaskulär forskning.
Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) har validerats på internationell nivå och är tillgängliga för in vitro-kardiotoxicitetsscreening1. Mycket rena hiPSC-CM kan genereras i praktiskt taget obegränsat antal, kryokonserveras och tinas. Vid omplätering återupplivas de också och börjar dra ihop sig med en rytm som påminner om det mänskliga hjärtat 2,3. Anmärkningsvärt är att enskilda hiPSC-CMs kopplas till varandra och bildar funktionell syncytia som slår som en enda vävnad. Numera härrör hiPSC rutinmässigt från patientens blodprover, så vem som helst kan representeras med hjälp av in vitro hiPSC-CM kardiotoxicitetsscreeninganalyser 4,5. Detta skapar möjlighet att utföra “kliniska prövningar i en maträtt”, med betydande representation från olika populationer6.
En kritisk fördel jämfört med befintliga screeningmetoder för djur- och djurcellskardiotoxicitet är att hiPSC-CMs använder hela det mänskliga genomet och erbjuder ett in vitro-system med genetiska likheter med det mänskliga hjärtat. Detta är särskilt attraktivt för farmakogenomik och personlig medicin – användningen av hiPSC-CM för medicinering och annan terapiutveckling förutspås ge mer exakta, exakta och säkra läkemedelsrecept. Faktum är att tvådimensionella (2D) hiPSC-CM-monolageranalyser har visat sig vara prediktiva för läkemedelskardiotoxicitet, med hjälp av en panel av kliniskt använda läkemedel med känd risk att orsaka arytmier 1,7,8,9. Trots hiPSC-CMs stora potential och löftet att effektivisera och göra läkemedelsutveckling billigare, har det funnits en motvilja mot att använda dessa nya analyser10,11,12.
Hittills är en stor begränsning av utbredd adoption och acceptans av hiPSC-CM-screeninganalyser deras omogna, fosterliknande utseende, liksom deras funktion. Den kritiska frågan om hiPSC-CM-mognad har granskats och debatterats i den vetenskapliga litteraturen ad nauseum13,14,15,16. På samma sätt har många metoder använts för att främja hiPSC-CM-mognad, inklusive extracellulära matrismanipulationer (ECM) i 2D-monolager och utveckling av 3D-konstruerade hjärtvävnader (EHT)17,18. För närvarande finns det en utbredd tro på att användningen av 3D EHT kommer att ge överlägsen mognad i förhållande till 2D-monolagerbaserade metoder. 2D-monolager ger emellertid en högre effektivitet av cellutnyttjande och ökad framgång vid plätering jämfört med 3D EHT; 3D EHT använder ett större antal celler och kräver ofta inkludering av andra celltyper som kan förvirra resultat. Därför ligger fokus i denna artikel på att använda en enkel metod för att mogna hiPSC-CMs odlade som 2D-monolager av elektriskt och mekaniskt kopplade celler.
Avancerad hiPSC-CM-mognad kan uppnås i 2D-monolager med hjälp av en ECM. 2D-monolagren av hiPSC-CM kan mogna med hjälp av ett mjukt, flexibelt polydimetylsiloxantäckglas, belagt med basalmembranmatris utsöndrad av en Engelbreth-Holm-Swarm-mussarkomcell (mus-ECM). År 2016 visade rapporter att hiPSC-CMs odlade på detta mjuka ECM-tillstånd mognade funktionellt och visade verkningspotentialens ledningshastigheter nära vuxna hjärtvärden (~ 50 cm / s)18. Vidare uppvisade dessa mogna hiPSC-CMs många andra elektrofysiologiska egenskaper som påminner om det vuxna hjärtat, inklusive hyperpolariserad vilomembranpotential och uttryck av Kir2.1. Mer nyligen identifierade rapporter en human perinatal stamcellshärledd ECM-beläggning som främjar strukturell mognad av 2D hiPSC-CMs19. Här presenteras lättanvända metoder för strukturellt mogna 2D hiPSC-CM-monolager för användning i elektrofysiologiska skärmar med hög kapacitet. Vidare tillhandahåller vi validering av ett optiskt kartläggningsinstrument för automatiserad insamling och analys av 2D hiPSC-CM monolayer elektrofysiologisk funktion, med hjälp av spänningskänsliga färgämnen (VSDs) och kalciumkänsliga sonder och proteiner.
Det finns flera olika metoder för in vitro kardiotoxicitet screening med hiPSC-CMs. Ett nyligen publicerat “Best Practices” -papper om användningen av hiPSC-CMs presenterade de olika in vitro-analyserna , deras primära avläsningar och viktigare, varje analyss granularitet för att kvantifiera human hjärtelektrofysiologisk funktion20. Förutom att använda membrangenomträngande elektroder tillhandahålls det mest direkta måttet på mänsklig hjärtelektrofysiologisk funktio…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har fått stöd av NIH-bidrag HL148068-04 och R44ES027703-02 (TJH).
0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
HBSS | Gibco | 14025-092 | |
iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | ||
iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
IWP4 | Tocris | 5214 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |