Summary

Origem e Rota de Contaminação por Alcaloide Pirrolizidínico em Amostras de Chá

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

O presente protocolo descreve a contaminação de alcaloides pirrolizidínicos (APs) em amostras de chá de plantas daninhas produtoras de AP em jardins de chá.

Abstract

Alcaloides pirrolizidínicos tóxicos (APs) são encontrados em amostras de chá, que representam uma ameaça à saúde humana. No entanto, a origem e a via de contaminação por AP em amostras de chá permanecem obscuras. Neste trabalho, um método adsorvente combinado com UPLC-MS/MS foi desenvolvido para determinar 15 APs em plantas daninhas Ageratum conyzoides L., solo rizosférico de A. conyzoides, folhas de chá fresco e amostras de chá seco. As recuperações médias variaram de 78%-111%, com desvios-padrão relativos de 0,33%-14,8%. Quinze pares de A. conyzoides e A. conyzoides rhizospheric amostras de solo e 60 amostras de folhas de chá fresco foram coletadas no jardim de chá Jinzhai na província de Anhui, China, e analisadas para os 15 APs. Nem todos os 15 APs foram detectados em folhas de chá fresco, exceto N-óxido intermediário (ImNO) e senecionina (Sn). O conteúdo de ImNO (34,7 μg/kg) foi maior que o de Sn (9,69 μg/kg). Além disso, tanto o ImNO quanto o Sn concentraram-se nas folhas jovens da planta de chá, enquanto seu conteúdo foi menor nas folhas velhas. Os resultados indicaram que os APs no chá foram transferidos através do caminho de plantas daninhas produtoras de AF – solo e folhas frescas de chá em jardins de chá.

Introduction

Como metabólitos secundários, os alcaloides pirrolizidínicos (APs) protegem as plantas contra herbívoros, insetos e patógenos 1,2. Até o momento, mais de 660 APs e óxidos de AP-N (PANOs) com diferentes estruturas foram encontrados em mais de 6.000 espécies de plantas em todo o mundo 3,4. Plantas produtoras de AP são encontradas principalmente nas famílias Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae e Apocynaceae 5,6. Os APs são facilmente oxidados a alcaloides desidropirrolizidínicos instáveis, que apresentam forte eletrofilicidade e podem atacar nucleófilos como DNA e proteínas, resultando em necrose das células hepáticas, oclusões venosas, cirrose, ascite e outros sintomas 7,8. O principal órgão-alvo da toxicidade da AP é o fígado. Os APs também podem causar toxicidade pulmonar, renal e de outros órgãos e toxicidade mutagênica, carcinogênica e de desenvolvimento 9,10.

Casos de intoxicação humana e animal têm sido relatados em muitos países a partir da ingestão de ervas tradicionais, suplementos ou chás contendo APs ou da contaminação indireta de alimentos como leite, mel ou carne (tóxicos pela ingestão de pastagens contendo APs)11,12,13. As conclusões da Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA) indicam que substâncias como o chá (herbal) são uma importante fonte de exposição humana a APs/PANOs14. Amostras de chá não produzem APs, enquanto plantas produtoras de AF são comumente encontradas em jardins de chá (por exemplo, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus e Ageratum conyzoides)15. Suspeitava-se anteriormente que o chá poderia estar contaminado com APs de suas plantas produtoras durante a colheita e processamento. No entanto, APs também foram detectados em algumas folhas de chá escolhidas manualmente (ou seja, sem plantas produtoras de AF), sugerindo que deve haver outras rotas ou fontes de contaminação16. Foi conduzido um experimento de co-cultivo de plantas de trapoeraba (Senecio jacobaea) com plantas de melissa (Melissa officinalis), hortelã-pimenta (Mentha piperita), salsa (Petroselinum crispum), camomila (Matricaria recutita) e nasturtium (Tropaeolum majus), cujos resultados mostraram que APs foram detectados em todas essas plantas17. Verificou-se que os APs são, de fato, transferidos e trocados entre plantas vivas via solo18,19. Van Wyk et al.20 verificaram que o chá de rooibos (Aspalathus linearis) estava severamente contaminado em locais ricos em plantas daninhas e continha APs do mesmo tipo e proporção. No entanto, não foram detectados APs no chá de rooibos em locais livres de plantas daninhas.

Atualmente, a cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (UPLC-MS/MS) com alta seletividade e sensibilidade tem sido amplamente utilizada na análise qualitativa e quantitativa de APs em produtos agrícolas ealimentícios21,22. O método de tratamento da amostra é geralmente composto por extração em fase sólida (SPE) ou limpeza QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) de extratos de matrizes alimentares complexas, que podem obter a maior sensibilidade possível12,19. No entanto, métodos analíticos robustos que permitam a detecção e quantificação de APs em matrizes complexas como solo, plantas daninhas e folhas de chá fresco ainda estão ausentes.

Este estudo analisou 15 APs em amostras de chá seco, folhas de chá fresco, plantas daninhas e amostras de solo rizosférico de plantas daninhas com UPLC-MS/MS combinado com um método de purificação por adsorvente. Além disso, 15 amostras pareadas de solo rizosférico de plantas daninhas e plantas daninhas e 60 amostras de folhas de chá fresco foram coletadas de cinco pontos de amostragem no jardim de chá Jinzhai na província de Anhui, China, e foram analisadas para 15 APs. Estes resultados podem fornecer um método de levantamento e algumas informações sobre a origem e rota de APs (contaminação) em amostras de chá para garantir a qualidade e segurança do chá.

Protocol

Para o presente estudo, foram coletadas as seguintes espécies de plantas daninhas: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. e Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore. As folhas de chá fresco foram colhidas da variedade de árvores de c…

Representative Results

O método otimizado de purificação e análise de adsorventes de 15 APs em amostras de chá seco, folhas de chá fresco, plantas daninhas e solo foi estabelecido e comparado com o método de purificação comumente usado usando o cartucho SPE. Os resultados mostraram que a recuperação dos 15 APs em amostras de chá seco, plantas daninhas e folhas de chá fresco usando o cartucho de SPE foi de 72%-120%, enquanto que com purificação de adsorvente foi de 78%-98% (Figura 1). As recuperaçõ…

Discussion

O presente trabalho foi projetado para desenvolver um método eficaz e sensível para explorar as rotas de contaminação e fontes de APs em amostras de chá, bem como a distribuição de APs em diferentes partes das plantas de chá. No entanto, neste estudo, apenas 15 APs foram separados com sucesso na coluna cromatográfica, o que é um número muito pequeno em comparação com o grande número de alcaloides nas espécies vegetais 3,4. Isso não só foi relacio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Scientific Foundation of China (32102244), pelo National Agricultural Products Quality and Safety and Risk Assessment Project (GJFP2021001), pela Natural Scientific Foundation of Anhui Province (19252002) e pelo USDA (HAW05020H).

Materials

Acetonitrile (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115197 CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 181210 CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%) Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) G0860050 CAS No:540-69-2
Carbon-GCB CNW B7760030 120-400 MESH, 10g. per box 
Centrifuge Z 36 HK HERMLE Z36HK 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea product Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun loose tea Green tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) BioCrick 323256 CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%) BioCrick 98222 CAS No:570-19-4
Formate (98.0%) Aladdin E2022005 CAS No:64-18-6
HC-C18 CNW D2110060 40-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%) BioCrick 906426 CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) BioCrick 22581 CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WS cence 203158000 Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 column Waters 186004976 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%) BioCrick 114843 CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) BioCrick 340066 CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%) BioCrick 132282048 CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) ChemFaces CFN00461 CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115100 CAS No:67-56-1
PSA Agela P19-00833 40-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%) BioCrick 5281743 CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) BioCrick 5281734 CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%) BioCrick 5280906 CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) BioCrick 5380876 CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) BioCrick 6442619 CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%) BioCrick 5281750 CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%) BioCrick 5281752 CAS No:2318-18-5
SPE PCX Agilent Technologies 12108206 Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 1003019 CAS No:7664-93-9
Trisodium citrate Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. 20121009 CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleaner Supmile KQ-600B Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMS Waters ZPLYY-003 Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillator Guoyu instrument SHY-2AHS Oscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C

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Cite This Article
Jiao, W., Shen, T., Wang, L., Zhu, L., Li, Q. X., Wang, C., Chen, H., Hua, R., Wu, X. Source and Route of Pyrrolizidine Alkaloid Contamination in Tea Samples. J. Vis. Exp. (187), e64375, doi:10.3791/64375 (2022).

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