차 샘플에서 Pyrrolizidine 알칼로이드 오염의 출처 및 경로
Summary
본 프로토콜은 차밭에서 PA를 생산하는 잡초의 차 샘플에서 피롤리지딘 알칼로이드(PA)의 오염을 설명합니다.
Abstract
독성 피롤리지딘 알칼로이드(PA)는 차 샘플에서 발견되어 인체 건강에 위협이 됩니다. 그러나 차 샘플에서 PA 오염의 원인과 경로는 불분명하다. 이 연구에서는 UPLC-MS/MS와 결합된 흡착 방법을 개발하여 잡초 Ageratum conyzoides L., A. conyzoides rhizospheric 토양, 신선한 찻잎 및 말린 차 샘플에서 15개의 PA를 측정했습니다. 평균 회수율은 78%-111% 범위였으며 상대 표준 편차는 0.33%-14.8%였습니다. 중국 안후이성의 진자이 차밭에서 15쌍의 A. conyzoides 및 A. conyzoides 근권 토양 샘플과 60개의 신선한 찻잎 샘플을 수집하여 15개의 PA에 대해 분석했습니다. 중간중간-N-옥사이드(ImNO)와 세네시오닌(Sn)을 제외하고 신선한 찻잎에서 15개의 PA가 모두 검출된 것은 아닙니다. ImNO(34.7μg/kg)의 함량은 Sn(9.69μg/kg)보다 컸습니다. 또한, ImNO와 Sn은 모두 차 나무의 어린 잎에 집중되어 있었고, 그 함량은 오래된 잎에서 더 낮았다. 결과는 차의 PA가 차밭에서 PA를 생산하는 잡초-토양-신선한 찻잎의 경로를 통해 옮겨진 것으로 나타났습니다.
Introduction
2차 대사산물인 피롤리지딘 알칼로이드(PA)는 초식동물, 곤충, 병원균으로부터 식물을 보호한다 1,2. 지금까지 전 세계적으로 6,000종 이상의 식물 종에서 서로 다른 구조를 가진 660개 이상의 PA와 PA-N-산화물(PANO)이 발견되었습니다 3,4. PA 생산 식물은 주로 국화과, 보라기과, 파바과, 아포시나과에서 발견됩니다 5,6. PA는 불안정한 디하이드로피롤리지딘 알칼로이드로 쉽게 산화되는데, 이는 강한 친전자성을 가지며 DNA 및 단백질과 같은 친핵체를 공격하여 간세포 괴사, 정맥 폐색, 간경변, 복수 및 기타 증상을 유발할 수 있습니다 7,8. PA 독성의 주요 표적 기관은 간입니다. PA는 또한 폐, 신장 및 기타 장기 독성과 돌연변이 유발 성, 발암 성 및 발달 독성을 유발할 수 있습니다 9,10.
PA가 함유된 전통 허브, 보충제 또는 차의 섭취 또는 우유, 꿀 또는 육류와 같은 식품의 간접적인 오염(PA가 포함된 목초지 섭취로 인한 독성)으로 인해 많은 국가에서 인간 및 동물 중독 사례가 보고되었습니다.11,12,13. 유럽식품안전청(EFSA)의 조사 결과에 따르면 (허브) 차와 같은 물질은 인체가 PA/PANO에 노출되는 중요한 원인이다14. 차 샘플은 PA를 생산하지 않는 반면, PA 생산 식물은 일반적으로 차밭에서 발견됩니다(예: Emilia sonchifolia, Senecio angulatus 및 Ageratum conyzoides)15. 이전에는 차가 수확 및 가공 중에 생산 공장의 PA로 오염될 수 있다고 의심되었습니다. 그러나 일부 손으로 딴 찻잎(즉, PA 생산 식물이 없음)에서도 PA가 검출되어 다른 경로나 오염원이 있어야 함을 시사한다16. 돼지풀(Senecio jacobaea)과 멜리사(Melissa officinalis), 페퍼민트(Mentha piperita), 파슬리(Petroselinum crispum), 카모마일(Matricaria recutita), 한련(Tropaeolum majus)의 공동 재배 실험을 실시한 결과, 이들 식물 모두에서 PA가 검출되는 것으로 나타났다17. PA는 실제로 토양18,19를 통해 살아있는 식물간에 전달되고 교환되는 것으로 확인되었습니다. Van Wyk et al.20은 루이보스 차(Aspalathus linearis)가 잡초가 풍부한 지역에서 심하게 오염되었으며 동일한 유형과 비율의 PA를 함유하고 있음을 발견했습니다. 그러나 잡초가 없는 지역의 루이보스 차에서는 PA가 검출되지 않았습니다.
현재 선택성과 감도가 높은 초고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법(UPLC-MS/MS)은 농산물 및 식품의 PA의 정성 및 정량 분석에 널리 사용되었습니다21,22. 시료 처리 방법은 일반적으로 고체상 추출법(SPE) 또는 복합 식품 매트릭스 추출물의 QuEChERS(Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) 세척으로 구성되며, 이는 가능한 가장 높은 감도12,19를 얻을 수 있습니다. 그러나 토양, 잡초 및 신선한 찻잎과 같은 복잡한 매트릭스에서 PA를 검출하고 정량화할 수 있는 강력한 분석 방법은 여전히 부족합니다.
이 연구는 흡착제 정제 방법과 결합된 UPLC-MS/MS를 사용하여 말린 차 샘플, 신선한 찻잎, 잡초 및 잡초 근권 토양 샘플에서 15개의 PA를 분석했습니다. 또한, 중국 안후이성 진자이 차밭의 5개 샘플링 장소에서 15쌍의 잡초 및 잡초 뿌리권 토양 샘플과 60개의 신선한 찻잎 샘플을 수집하여 15개의 PA에 대해 분석했습니다. 이러한 결과는 차의 품질과 안전성을 보장하기 위해 차 샘플에서 PA(오염)의 출처 및 경로에 대한 조사 방법과 일부 정보를 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 연구는 차 샘플에서 PA의 오염 경로와 출처를 탐색하고 차 식물의 다른 부분에서 PA의 분포를 탐색하는 효과적이고 민감한 방법을 개발하도록 설계되었습니다. 그러나 이 연구에서는 크로마토그래피 컬럼에서 15개의 PA만이 성공적으로 분리되었으며, 이는 식물 종 3,4의 많은 수의 알칼로이드에 비해 매우 적은 수입니다. 이것은 컬럼 자체의 패킹 특…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (32102244), 국가 농산물 품질 및 안전 및 위험 평가 프로젝트 (GJFP2021001), 안후이 성 자연 과학 재단 (19252002) 및 USDA (HAW05020H)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Acetonitrile (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115197 | CAS No:75-05-8 |
| Ammonia (25%-28%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 181210 | CAS No:1336-21-6 |
| Ammonium formate (97.0%) | Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) | G0860050 | CAS No:540-69-2 |
| Carbon-GCB | CNW | B7760030 | 120-400 MESH, 10g. per box |
| Centrifuge Z 36 HK | HERMLE | Z36HK | 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm |
| Commercially available tea product | Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun | loose tea | Green tea |
| Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) | BioCrick | 323256 | CAS No:65582-53-8 |
| Europine (Eu) (98.0%) | BioCrick | 98222 | CAS No:570-19-4 |
| Formate (98.0%) | Aladdin | E2022005 | CAS No:64-18-6 |
| HC-C18 | CNW | D2110060 | 40-63 μm,100g.per box |
| Heliotrine (He) (98.0%) | BioCrick | 906426 | CAS No:303-33-3 |
| Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) | BioCrick | 22581 | CAS No:6209-65-0 |
| High speed centrifuge TG16-WS | cence | 203158000 | Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL |
| HSS T3 column | Waters | 186004976 | ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm) |
| Intermedine (Im) (98.0%) | BioCrick | 114843 | CAS No:10285-06-0 |
| Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) | BioCrick | 340066 | CAS No:95462-14-9 |
| Jacobine (Jb) (98.0%) | BioCrick | 132282048 | CAS No:6870-67-3 |
| Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) | ChemFaces | CFN00461 | CAS No:38710-25-7 |
| Methyl Alcohol (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115100 | CAS No:67-56-1 |
| PSA | Agela | P19-00833 | 40-60 μm, 60 Å 100g.per box |
| Retrorsine (Re) (98.0%) | BioCrick | 5281743 | CAS No:480-54-6 |
| Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) | BioCrick | 5281734 | CAS No:15503-86-3 |
| Senecionine (Sc) (98.0%) | BioCrick | 5280906 | CAS No:130-01-8 |
| Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) | BioCrick | 5380876 | CAS No:13268-67-2 |
| Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) | BioCrick | 6442619 | CAS No:38710-26-8 |
| Seneciphylline (Sp) (98.0%) | BioCrick | 5281750 | CAS No:480-81-9 |
| Senkirkine (Sk) (98.0%) | BioCrick | 5281752 | CAS No:2318-18-5 |
| SPE PCX | Agilent Technologies | 12108206 | Cation Mixed Mode, 6 mL |
| Sulfuric acid (97%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 1003019 | CAS No:7664-93-9 |
| Trisodium citrate | Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20121009 | CAS No:6132-04-3 |
| Ultrasonic cleaner | Supmile | KQ-600B | Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L |
| UPLC-xevoTQMS | Waters | ZPLYY-003 | Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System |
| Water bath thermostat oscillator | Guoyu instrument | SHY-2AHS | Oscillation times: 60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C |
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