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Immunology and Infection

वायरल सह-संक्रमण पर कॉलोनाइजर से रोगज़नक़ तक स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया के संक्रमण के लिए एक माउस मॉडल उम्र-बढ़ी हुई बीमारी को पुन: उत्पन्न करता है

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64419
Automatic Translation
*1, *2,3, 2, 4, 2,5, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Microbiology, Tufts University School of Medicine, 3Graduate Program in Immunology, Tufts Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Translational Medicine, Lund University, 5Stuart B. Levy Center for the Integrated Management of Antimicrobial Resistance, Tufts University
* These authors contributed equally

Summary

यह पेपर वायरल संक्रमण के दौरान एक स्पर्शोन्मुख कॉलोनाइजर से रोग पैदा करने वाले रोगज़नक़ में न्यूमोकोकस के संक्रमण के लिए एक नए माउस मॉडल का वर्णन करता है। इस मॉडल को रोग की प्रगति के विभिन्न चरणों के दौरान और विभिन्न मेजबानों में पॉलीमाइक्रोबियल और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (न्यूमोकोकस) ज्यादातर व्यक्तियों में नासोफेरिंक्स का एक स्पर्शोन्मुख कॉलोनाइजर है, लेकिन इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) संक्रमण पर फुफ्फुसीय और प्रणालीगत रोगज़नक़ में प्रगति कर सकता है। उन्नत आयु द्वितीयक न्यूमोकोकल निमोनिया के लिए मेजबान संवेदनशीलता को बढ़ाती है और खराब रोग परिणामों से जुड़ी होती है। उन प्रक्रियाओं को चलाने वाले मेजबान कारकों को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं किया गया है, आंशिक रूप से पशु मॉडल की कमी के कारण जो स्पर्शोन्मुख उपनिवेशीकरण से गंभीर नैदानिक बीमारी में संक्रमण को पुन: पेश करते हैं।

यह पेपर एक उपन्यास माउस मॉडल का वर्णन करता है जो वायरल संक्रमण पर स्पर्शोन्मुख गाड़ी से बीमारी में न्यूमोकोकी के संक्रमण को फिर से बनाता है। इस मॉडल में, चूहों को पहले बायोफिल्म-विकसित न्यूमोकोकी के साथ इंट्रानेसल रूप से टीका लगाया जाता है ताकि स्पर्शोन्मुख गाड़ी स्थापित की जा सके, इसके बाद नासोफैरिंक्स और फेफड़ों दोनों के आईएवी संक्रमण होता है। इसके परिणामस्वरूप फेफड़ों में जीवाणु प्रसार, फुफ्फुसीय सूजन और बीमारी के स्पष्ट संकेत होते हैं जो घातकता में प्रगति कर सकते हैं। रोग की डिग्री जीवाणु तनाव और मेजबान कारकों पर निर्भर है।

महत्वपूर्ण रूप से, यह मॉडल उम्र बढ़ने की संवेदनशीलता को पुन: पेश करता है, क्योंकि युवा चूहों की तुलना में, पुराने चूहे अधिक गंभीर नैदानिक बीमारी प्रदर्शित करते हैं और अधिक बार बीमारी का शिकार होते हैं। गाड़ी और बीमारी को अलग-अलग चरणों में अलग करके और रोगज़नक़ और मेजबान दोनों के आनुवंशिक रूपों का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करके, यह एस निमोनिया / आईएवी सह-संक्रमण मॉडल रोग की प्रगति के विभिन्न चरणों में मेजबान के साथ एक महत्वपूर्ण पैथोबायोन्ट की बातचीत की विस्तृत परीक्षा की अनुमति देता है। यह मॉडल अतिसंवेदनशील मेजबानों में माध्यमिक न्यूमोकोकल निमोनिया के खिलाफ संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में भी काम कर सकता है।

Introduction

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (न्यूमोकोकस) ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया हैं जो स्पर्शोन्मुख रूप से अधिकांश स्वस्थ व्यक्तियों के नासोफैरिंक्स में रहते हैं। उन कारकों द्वारा प्रचारित जो पूरी तरह से परिभाषित नहीं हैं, न्यूमोकोकी नासोफेरिंक्स के सौम्य कॉलोनाइजरों से रोगजनकों में संक्रमण कर सकता है जो अन्य अंगों में फैल जाते हैं जिसके परिणामस्वरूप ओटिटिस मीडिया, निमोनिया और बैक्टेरेमिया 3 सहित गंभीर संक्रमणहोते हैं। न्यूमोकोकल रोग प्रस्तुति, आंशिक रूप से, सीरोटाइप सहित तनाव-विशिष्ट मतभेदों पर निर्भर है, जो कैप्सुलर पॉलीसेकेराइड की संरचना पर आधारित है। अब तक 100 से अधिक सीरोटाइप की विशेषता है, और कुछ अधिक आक्रामक संक्रमण 4,5 से जुड़े हैं। कई अन्य कारक न्यूमोकोकल बीमारी के जोखिम को बढ़ाते हैं। ऐसा ही एक कारक वायरल संक्रमण है, जहां न्यूमोकोकल निमोनिया का खतरा आईएवी 6,7 से 100 गुना बढ़ जाता है। ऐतिहासिक रूप से, एस निमोनिया इन्फ्लूएंजा के बाद द्वितीयक जीवाणु निमोनिया के सबसे आम कारणों में से एक है और बदतरपरिणामों से जुड़ा हुआ है। एक और प्रमुख जोखिम कारक उन्नत उम्र है। वास्तव में, एस निमोनिया 65 वर्ष से अधिक उम्र के बुजुर्ग व्यक्तियों में समुदाय-अधिग्रहित जीवाणु निमोनिया का प्रमुख कारण है। बुजुर्ग व्यक्ति निमोनिया और इन्फ्लूएंजा के कारण होने वाली मौतों के बहुमत (>75%) के लिए जिम्मेदार हैं, यह दर्शाता है कि दो जोखिम कारक- उम्र बढ़ने और आईएवी संक्रमण-सहक्रियात्मक रूप से बीमारी की संवेदनशीलता 11,12,13,14 को खराब करते हैं। हालांकि, जिस तंत्र के द्वारा वायरल संक्रमण स्पर्शोन्मुख कॉलोनाइजर से आक्रामक रोगज़नक़ में न्यूमोकोकी के संक्रमण का संकेत देता है और मेजबान कारकों द्वारा इसे कैसे आकार दिया जाता है, यह खराब रूप से परिभाषित है। यह काफी हद तक एक छोटे पशु मॉडल की अनुपस्थिति के कारण है जो स्पर्शोन्मुख न्यूमोकोकल उपनिवेशीकरण से महत्वपूर्ण नैदानिक बीमारी में संक्रमण को पुन: उत्पन्न करता है।

सह-संक्रमण अध्ययनों को शास्त्रीय रूप से चूहों में मॉडलिंग किया गया है, जिन्हें इन्फ्लूएंजा संक्रमण15,16 के 7 दिनों के बाद सीधे फेफड़ों में न्यूमोकोकी के साथ टीका लगाया गया है। यह द्वितीयक जीवाणु निमोनिया के लिए संवेदनशीलता को पुन: उत्पन्न करता है और यह अध्ययन करने के लिए आदर्श है कि एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं जीवाणुरोधी सुरक्षाको कैसे खराब करती हैं। हालांकि, मनुष्यों में अनुदैर्ध्य अध्ययनों से पता चला है कि नासोफेरिंक्स में न्यूमोकोकल कैरिज, जहां बैक्टीरिया स्पर्शोन्मुख बायोफिल्म18 बना सकता है, समान रूप से आक्रामक बीमारियों19,20 से जुड़ा हुआ है। मध्य कान, फेफड़े और रक्त के संक्रमण से बैक्टीरियल आइसोलेट्स आनुवंशिक रूप से नासोफैरिंक्स20 में पाए जाने वाले समान हैं। इस प्रकार, आईएवी संक्रमण के बाद स्पर्शोन्मुख गाड़ी से आक्रामक बीमारी में संक्रमण का अध्ययन करने के लिए, एक मॉडल स्थापित किया गया था जिसमें चूहों को इंट्रानेसल रूप से प्रशासित बायोफिल्म-विकसित न्यूमोकोकी के बाद नासोफैरिंक्स21,22 का आईएवी संक्रमण दिया गया था। ऊपरी वायुमार्ग के वायरल संक्रमण ने मेजबान वातावरण में परिवर्तन किया जिसके कारण बायोफिल्म से न्यूमोकोकी का फैलाव हुआ और निचले वायुमार्गमें उनका प्रसार हुआ। इन छितरी हुई बैक्टीरिया में संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण विषाणु कारकों की अनियमित अभिव्यक्ति थी, जो उन्हें कॉलोनाइजर से रोगजनकोंमें परिवर्तित करती थी। ये अवलोकन वायरस, मेजबान और बैक्टीरिया के बीच जटिल बातचीत को उजागर करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि वायरल संक्रमण से शुरू होने वाले मेजबान में परिवर्तन का न्यूमोकोकल व्यवहार पर सीधा प्रभाव पड़ता है, जो बदले में, जीवाणु संक्रमण के पाठ्यक्रम को बदल देता है। हालांकि, यह मॉडल मनुष्यों में देखी गई बीमारी के गंभीर लक्षणों को पुन: उत्पन्न करने में विफल रहता है, संभवतः क्योंकि वायरस नाक गुहा तक सीमित है, और मेजबान प्रतिरक्षा और फेफड़ों की क्षति पर वायरल संक्रमण के प्रणालीगत प्रभाव ों को पुन: परिभाषित नहीं किया जाता है।

हमने हाल ही में एक मॉडल स्थापित किया है जो मेजबान और रोगजनकों के बीच जटिल बातचीत को शामिल करता है, लेकिन मनुष्यों में देखी गई बीमारी की गंभीरता की अधिक बारीकी से नकल करताहै। इस मॉडल में, चूहों को पहले बायोफिल्म-विकसित न्यूमोकोकी के साथ इंट्रानेसल रूप से संक्रमित किया जाता है ताकि स्पर्शोन्मुख गाड़ी स्थापित की जा सके, इसके बाद नासोफेरिंक्स और फेफड़ों दोनों के आईएवी संक्रमण होता है। इसके परिणामस्वरूप फेफड़ों में जीवाणु प्रसार, फुफ्फुसीय सूजन और बीमारी हुई जो युवा चूहोंके एक अंश में घातकता में प्रगति हुई। इस पिछले अध्ययन से पता चला है कि वायरल और बैक्टीरियल संक्रमण दोनों ने मेजबान रक्षा को बदल दिया: वायरल संक्रमण ने जीवाणु प्रसार को बढ़ावा दिया, और पूर्व जीवाणु उपनिवेशीकरण ने फुफ्फुसीय आईएवीस्तरों को नियंत्रित करने के लिए मेजबान की क्षमता को खराब कर दिया। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच से पता चला कि आईएवी संक्रमण ने न्यूट्रोफिल की जीवाणुरोधी गतिविधि को कम कर दिया, जबकि जीवाणु उपनिवेशीकरण ने एंटीवायरल रक्षा के लिए महत्वपूर्ण टाइप1 इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया को कुंद कर दिया। महत्वपूर्ण रूप से, इस मॉडल ने उम्र बढ़ने की संवेदनशीलता को पुन: पेश किया। युवा चूहों की तुलना में, पुराने चूहों ने पहले बीमारी के लक्षण प्रदर्शित किए, अधिक गंभीर नैदानिक बीमारी दिखाई, औरअधिक बार संक्रमण के कारण दम तोड़ दिया। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत कार्य से पता चलता है कि रोग की डिग्री बैक्टीरिया के तनाव पर भी निर्भर है, क्योंकि आक्रामक न्यूमोकोकल उपभेद आईएवी संक्रमण पर अधिक कुशल प्रसार प्रदर्शित करते हैं, फुफ्फुसीय सूजन के अधिक संकेत दिखाते हैं, और इसके परिणामस्वरूप गैर-इनवेसिव उपभेदों की तुलना में रोग की त्वरित दर होती है। इस प्रकार, यह एस निमोनिया / आईएवी सह-संक्रमण मॉडल रोगज़नक़ और मेजबान दोनों कारकों की विस्तृत परीक्षा की अनुमति देता है और रोग की प्रगति के विभिन्न चरणों में पॉलीमाइक्रोबियल संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

Protocol

प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुपालन में सभी पशु अध्ययन किए गए थे। सभी प्रक्रियाओं को बफ़ेलो संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति में विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया (सीडीएम) तैयार करना

  1. स्टॉक निम्नानुसार तैयार करें:
    1. तालिका 1 में सूचीबद्ध मिश्रण I यौगिकों को 100 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी में हिलाते हुए घोलें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 200 μL एलिकोट में स्टोर करें।
    2. तालिका 1 में सूचीबद्ध मिश्रण II यौगिकों को हिलाते समय 0.1 M NaOH के 20 mL में घोलें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μL एलिकोट में स्टोर करें।
    3. तालिका 1 में सूचीबद्ध मिश्रण III यौगिकों को हिलाते समय अल्ट्राप्योर पानी के 1 एमएल में घोलें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 μL एलिकोट में स्टोर करें।
    4. तालिका 1 में सूचीबद्ध मिश्रण IV यौगिक को हिलाते हुए अल्ट्राप्योर पानी के 1 एमएल में घोलें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 μL एलिकोट में स्टोर करें।
    5. तालिका 2 में सूचीबद्ध यौगिकों को प्रारंभ में 15 एमएल अल्ट्राप्योर पानी में हिलाते हुए घोलें। 0.1 एम एनएओएच की कुछ बूंदों के साथ पीएच को 7.0 में समायोजित करें और अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके अंतिम मात्रा को 20 एमएल तक समायोजित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट में स्टोर करें।
    6. तालिका 3 में सूचीबद्ध यौगिकों को 90 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी में एक गर्म प्लेट पर 50 डिग्री सेल्सियस पर हिलाते हुए घोलें। पीएच को 0.1 एम एनएओएच के साथ 7.0 में समायोजित करें, और फिर अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके अंतिम मात्रा को 100 एमएल तक समायोजित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 एमएल एलिकोट में स्टोर करें।
  2. तालिका 4 में यौगिकों को हिलाते हुए 70 एमएल अल्ट्राप्योर पानी में घोलकर स्टार्टर स्टॉक को हर बार ताजा बनाएं।
  3. ताजा स्टार्टर स्टॉक में, निम्नलिखित मिक्स स्टॉक को क्रम में जोड़ें: मिक्स I स्टॉक का 200 μL (तालिका 1), मिक्स II स्टॉक का 80 μL (तालिका 1), मिक्स III स्टॉक का 10 μL (तालिका 1), मिक्स IV स्टॉक का 10 μL (तालिका 2), विटामिन स्टॉक का 1 एमएल (तालिका 3), और एमिनो एसिड स्टॉक का 5 एमएल (तालिका 4)।
  4. एक बार स्टॉक जोड़े जाने के बाद, बीकर में 30 एमएल अल्ट्राप्योर पानी जोड़कर अंतिम मात्रा को 100 एमएल तक समायोजित करें।
  5. तालिका 4 से यौगिकों के साथ सीडीएम को पूरक करें। एक बार अच्छी तरह से मिश्रित होने के बाद, फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें और अधिकतम 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एस निमोनिया बायोफिल्म बढ़ाना

  1. आरपीएमआई 1640 के 445 एमएल को क्रमशः 10,000 यू /एमएल और 10,000 μg / mL पर 50 एमएल हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ मिलाकर आरपी -10 माध्यम तैयार करें।
  2. एनसीआई-एच 292 (एच 2 9 2) म्यूकोएपिडर्मोइड कार्सिनोमा सेल लाइन विकसित करें। टी -25 ऊतक संस्कृति-उपचारित फ्लास्क में आरपी -10 माध्यम के 5 एमएल में एक खरीदी गई शीशी से कोशिकाओं को जोड़ें। 100% संगम तक पहुंचने के लिए 3-5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  3. कंफ्लुएंसी का आकलन करने के लिए 10x आवर्धन का उपयोग करके प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें।
    नोट: जब सभी कोशिकाएं अन्य कोशिकाओं के संपर्क में होती हैं और बीच में कोई अंतराल नहीं होता है, तो वांछित 100% सामंजस्य तक पहुंच जाता है।
  4. कमरे के तापमान पीबीएस के 5 एमएल में कोशिकाओं को 2 गुना धोएं। सुनिश्चित करें कि बफर कैल्शियम मुक्त है ताकि अगले चरण में ईडीटीए को चेलेट करने से बचा जा सके।
  5. फ्लास्क में ट्रिप्सिन-ईडीटीए का 1 एमएल जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं अलग न हो जाएं। आरपी -10 माध्यम के 4 एमएल के साथ बेअसर करें। धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. एक ऊतक संस्कृति-उपचारित 24-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के 500 μL जोड़ें। एक कंफ्लुएंट टी -25 फ्लास्क से, 2 × 106-4 × 106 कोशिकाओं / एमएल की उम्मीद करें।
  7. अगले दिन, यह सुनिश्चित करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें कि वे स्थिर हैं, जैसा कि चरण 2.3 में है। यदि वे नहीं हैं, तो लंबे समय तक इनक्यूबेट करें।
  8. एक बार जब एच 292 कोशिकाएं 24-वेल प्लेट में 100% कॉन्फ्लुएंट हो जाती हैं, तो धीरे से कोशिकाओं को कमरे के तापमान वाले पीबीएस के 1 एमएल के साथ 3x धोएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि एंटीबायोटिक्स या मलबे वाला कोई माध्यम नहीं बचा है।
  9. कोशिकाओं को धोने के बाद, कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 250 μL / बर्फ पर 1 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. सेल निर्धारण से पहले की रात, रक्त एगर प्लेटों पर रुचि के एस निमोनिया तनाव को लकीरें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यहां प्रस्तुत डेटा सहयोगी विनिमय के माध्यम से प्राप्त निम्नलिखित एस निमोनिया उपभेदों के साथ हैं: सीरोटाइप 19 एफ ओटिटिस मीडिया आइसोलेट ईएफ 303024, शास्त्रीय सीरोटाइप 2 एवरी स्ट्रेन डी 3 925, और सीरोटाइप 4 बैक्टेरेमिया आइसोलेट टीआईजीआर 426। उपभेद सामग्री की तालिका में संदर्भित सार्वजनिक संग्रह से भी उपलब्ध हैं।
  11. सीडीएम के 20 एमएल में 100 μL ऑक्सीरेस (30 U/mL) जोड़कर CDM प्लस ऑक्सीरेस (0.15 U/mL) तैयार करें।
    नोट: ऑक्सीरेस का उपयोग ऑक्सीजन को खत्म करने के लिए किया जाता है ताकि तरलसंस्कृति 27 में एस निमोनिया के कुशल विकास की अनुमति मिल सके।
  12. प्लेट से बैक्टीरिया को ताजा सीडीएम + ऑक्सीरेस में इंजेक्ट करें, सीडीएम + ऑक्सीरेस के 1 एमएल जोड़कर प्लेट से बैक्टीरिया को धोएं और धीरे से 1 एमएल पिपेट टिप के किनारे का उपयोग करके बैक्टीरिया कॉलोनियों को उठाएं, सावधान रहें कि आगर को खुरच न दें। वैकल्पिक रूप से, बैक्टीरिया को उठाने के लिए एक इंजेक्शन लूप का उपयोग करें और उन्हें सीडीएम + ऑक्सीरेस के 1 एमएल युक्त ट्यूब में टीका लगाएं।
  13. सीडीएम + ऑक्सीरेस में बैक्टीरिया को0.05 के शुरुआती ओडी 600 में पतला करें।
  14. बैक्टीरिया को 37 डिग्री सेल्सियस /5% सीओ 2 पर खड़े एक शिथिल कैप्ड 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में तब तक उगाएं जब तककि 0.2 का ओडी600 तक नहीं पहुंच जाता (इसमें 2-5 घंटे के बीच कहीं भी समय लगेगा)। यह सुनिश्चित करने के लिए हर घंटे ओडी600 की जांच करें कि ओडी 0.2 से अधिक न हो।
  15. एक बार जब ओडी 0.2 तक पहुंच जाता है, तो भंवर बैक्टीरियल कल्चर ट्यूब होता है। निश्चित H292 कोशिकाओं पर बैक्टीरिया के 0.5 एमएल बीज और प्रति अच्छी तरह से सीडीएम + ऑक्सीरेस माध्यम के एक और 0.5 एमएल जोड़ें। बिना किसी बैक्टीरिया के नियंत्रण कुओं में 1 एमएल सीडीएम + ऑक्सीरेस जोड़ें। प्लेट को 34 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: 34 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि का उपयोग नासोफैरिंक्स21 में कम तापमान की अधिक बारीकी से नकल करने के लिए किया जाता है।
  16. प्रारंभिक बीजारोपण के बाद हर 12 घंटे, धीरे से माध्यम के 0.5 एमएल को हटा दें और 0.5 एमएल ताजा सीडीएम + ऑक्सीरेस के साथ फिर से भरें। बायोफिल्म बनाने को बाधित न करने के लिए सावधान रहें। बायोफिल्म के लिए प्लेट के निचले हिस्से की जांच करें और बायोफिल्म के विकास के कारण समय बीतने के साथ बढ़ते बादल की तलाश करें। संदूषण को नियंत्रित करने के लिए, बैक्टीरिया के बिना कुओं की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि नियंत्रण कुएं स्पष्ट रहें।
  17. टीकाकरण के बाद 48 घंटे पर, सतह पर तैरने वाले को हटा दें और 1 एमएल पीबीएस के साथ 2 गुना बहुत धीरे से धो लें। बायोफिल्म को उठाने के लिए 1 एमएल ताजा सीडीएम और पिपेट को जोर से ऊपर और नीचे में पुन: निलंबित करें। प्रत्येक जीवाणु तनाव के लिए, सभी कुओं से बैक्टीरिया को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूल करें। कसकर ढकी हुई ट्यूब को धीरे-धीरे कई बार ऊपर और नीचे झुकाकर अच्छी तरह मिलाएं।
  18. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, 20% ग्लिसरॉल की अंतिम एकाग्रता के साथ जीवाणु निलंबन प्राप्त करने के लिए सीडीएम में समान मात्रा में 40% ग्लिसरॉल जोड़ें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल एलिकोट करें, सूखी बर्फ पर फ्लैश-फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर सहेजें।
  19. उपयोग करने से पहले, बर्फ पर एक एलिकोट को पिघलाकर, ट्यूब को 5 मिनट के लिए 1,700 × ग्राम पर घुमाकर, सतह पर तैरने वाले को हटाकर, पीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से स्थिर करके, और रक्त एगर प्लेटों28 पर सीरियल कमजोर पड़ने से बैक्टीरिया की गणना करें।
  20. 37 डिग्री सेल्सियस /5% सीओ2 पर रात भर आगर प्लेटों को उगाएं और कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) / एमएल में जीवाणु एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कॉलोनियों को प्रासंगिक कमजोर पड़ने पर गिनती करें।
    नोट: ठंड के कम से कम एक दिन बाद या बाद में स्टॉक में बैक्टीरिया की गणना करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि पहले 24 घंटे के भीतर बैक्टीरिया की व्यवहार्यता में गिरावट होती है। संग्रहीत जमे हुए एलिकोट का उपयोग अधिकतम 2 महीने के लिए चूहों के बाद के संक्रमण के लिए किया जा सकता है।

3. बायोफिल्म-विकसित एस निमोनिया के साथ चूहों का इंट्रानेसल टीकाकरण

  1. चूहों को खरीदें और वांछित उम्र में उपयोग करें।
    नोट: 3-4 महीने की आयु के चूहों को युवा मेजबानों को मॉडल करने के लिए पसंद किया जाता है, और 21-24 महीने की आयु के चूहों का उपयोग29 वर्ष की आयु >65 वर्ष के बुजुर्ग व्यक्तियों को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत डेटा सी 57बीएल / 6 नर चूहों के साथ हैं।
  2. बर्फ पर बायोफिल्म-विकसित बैक्टीरियल एलिकोट को पिघलाएं और 5 मिनट के लिए 1,700 × ग्राम पर घूमें। गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें और छोड़ दें, 1 एमएल पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करके बैक्टीरिया को धोएं, और 5 मिनट के लिए 1,700 × ग्राम पर फिर से स्पिन करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और वांछित एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें (इंट्रानेजल टीकाकरण के लिए 5 × 106 सीएफयू / 10 μL का लक्ष्य रखें)। चरण 2.19 में रक्त एगर प्लेटों पर तैयार इनोकुलम चढ़ाकर प्रशासित बैक्टीरिया की मात्रा की पुष्टि करें।
  3. चूहों को 5 से 10 × 6 सीएफयू के साथ इंट्रानेसल रूप से टीका लगायाजाए , जिसमें प्रत्येक नारिस में पतला इनोकुलम के 5 μL को पाइप किया जाए। चूहों को मजबूती से पकड़ना सुनिश्चित करें, सिर को स्थिर करें, जब तक कि मात्रा साँस न ले ली जाए (आमतौर पर नरेस में मात्रा को कम करने के सेकंड के भीतर)। इनोकुलम की फुफ्फुसीय आकांक्षा को रोकने के लिए संज्ञाहरण की अनुपस्थिति में इस चरण को करें।

4. इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) के साथ वायरल संक्रमण

  1. एस निमोनिया के साथ इंट्रानेजल टीकाकरण के बाद 48 घंटे में, बर्फ पर रुचि के आईएवी तनाव को पिघलाएं।
    नोट: यहां प्रस्तुत डेटा इन्फ्लूएंजा ए वायरस ए / पीआर / 8/34 एच 1 एन 1 के माउस-अनुकूलित तनाव के साथ हैं जो सहयोगी एक्सचेंज30 के माध्यम से प्राप्त किया गया था।
  2. एक बार जब वायरस पिघल जाता है, तो पीबीएस में वायरस को वांछित एकाग्रता तक पतला करें; इंट्राट्रैकियल संक्रमण के लिए 20 पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू)/50 μL और इंट्रानेजल संक्रमण के लिए 200 PFU/10 μL का लक्ष्य है। मॉक-संक्रमित और बैक्टीरिया-केवल समूहों के लिए, चूहों को टीका लगाने के लिए पीबीएस का उपयोग करें।
  3. संज्ञाहरण से पहले चूहों की आंखों पर नेत्र स्नेहक रखें। 5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें और एक दृढ़ पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
  4. एक बार जब जानवर एनेस्थेटाइज हो जाता है, तो इसे आइसोफ्लुरेन कक्ष से हटा दें और तुरंत जीभ को मुंह से बाहर खींचने और श्वासनली के नीचे तरल की मात्रा को कम करने के लिए कुंद चिमटी का उपयोग करके आईएवी के 50 μL (20 PFU) के साथ एनेस्थेटाइज्ड चूहों को संक्रमित करें।
  5. चूहों को एक अलग पिंजरे में रखें और पूरी तरह से ठीक होने तक निगरानी करें (वे स्टर्नल रिकंबेंसी को बनाए रखने में सक्षम हैं [छाती पर सीधे लेटने में सक्षम)।)।
  6. ठीक होने के बाद, चरण 3.3 में टीकाकरण विधि का उपयोग करके आईएवी के 10 μL (200 PFU) के साथ चूहों को तुरंत इंट्रानेसल रूप से टीका लगाया जाता है।
  7. घर के चूहे जो एक ही संक्रमण समूह के साथ एकल या दोहरे जीवाणु और वायरल संक्रमण से गुजरे हैं और उन्हें अन्य समूहों से अलग करते हैं।

5. रोग के लक्षणों के लिए चूहों की निगरानी

  1. कम से कम 10 दिनों के लिए रोजाना चूहों की निगरानी करें और बीमारी के संकेतों के लिए आंख बंद करके स्कोर करें:
    1. वजन घटाने के लिए निम्नानुसार स्कोर: 0 = 5% या उससे कम; 1 = 5% -10%; 2 = 10% -15%; 3 = 20% या अधिक वजन घटाने का स्कोर 3 पर होने पर सीओ2 इनहेलेशन का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत्यु करें।
    2. गतिविधि के लिए निम्नानुसार स्कोर: 0 = सामान्य / 1 = गतिशील लेकिन थोड़ा कम हो गया; 2 = कम; 3 = गंभीर रूप से कम/सुस्ती (केवल स्पर्श करने पर चलती है), 4 = कोमा/गतिहीन। गतिविधि स्कोर 3 पर होने पर चूहों को इच्छामृत्यु करें।
    3. मुद्रा के लिए निम्नानुसार स्कोर: 0 = कोई कूबड़ (सामान्य); 1 = थोड़ा झुका हुआ आसन; 2 = गंभीर कूबड़। जब मुद्रा स्कोर 2 पर होता है तो चूहों को इच्छामृत्यु करें।
    4. आंखों के लिए निम्नानुसार स्कोर: 0 = सामान्य; 1 = उभरा हुआ; 1 = डूबा हुआ; 1 = बंद; 1 = निर्वहन। यह एक संयोजन हो सकता है। अंतिम आंख स्कोर के लिए योग जोड़ें।
    5. श्वास के लिए निम्नानुसार स्कोर: 0 = सामान्य श्वास; 1 = अनियमित या परिवर्तित (उच्च / निम्न दर); 2 = श्रम (अतिरंजित प्रयास या हांफना)। जब श्वास स्कोर 2 पर होता है तो चूहों को इच्छामृत्यु करें।
  2. उपरोक्त मानदंडों के आधार पर, स्वस्थ (0) के कुल नैदानिक स्कोर के लिए व्यक्तिगत स्कोर को बेहद बीमार (15) में जोड़ें। 2 से ऊपर कुल स्कोर प्रदर्शित करने वाले किसी भी माउस को बीमार होने के लिए विचार करें। 9 से ऊपर का कुल स्कोर या प्रत्येक मानदंड के लिए संकेतित स्कोर प्रदर्शित करने वाले किसी भी चूहे को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दें और उन्हें उत्तरजीविता वक्र पर चिह्नित करें।

6. जीवाणु गणना के लिए संक्रमित ऊतकों का प्रसंस्करण

  1. आईएवी संक्रमण के बाद 48 घंटे में, चूहों को इच्छामृत्यु दें।
  2. माउस को लापरवाह स्थिति में रखें। 70% इथेनॉल का उपयोग करके, फर को साफ करने के लिए माउस की छाती और पेट को स्प्रे करें। बल का उपयोग करके, माउस के बीच में फर और त्वचा को चुटकी लें और यकृत से छाती तक के क्षेत्र को उजागर करने के लिए विच्छेदन कैंची में 4.5 के साथ फर को काटें।
  3. रक्त संग्रह
    1. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, यकृत को उजागर करने के लिए पेरिटोनियल गुहा में धीरे से काट लें। फोर्सप्स का उपयोग करके, डायाफ्राम के पास यकृत के शीर्ष पर यकृत पोर्टल नस को उजागर करें। विच्छेदन कैंची का उपयोग करके हेपेटिक पोर्टल नस को काटें। एक बार जब रक्त पेरिटोनियल गुहा में जमा होना शुरू हो जाता है, तो माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 10 μL रक्त एकत्र करें और जीवाणु बोझ के लिए चढ़ाना के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एंटीकोआगुलेंट समाधान (पीबीएस में 50 mM EDTA समाधान) के 90 μL में रखें।
    2. शेष रक्त को इकट्ठा करने के लिए पी -1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, इसे रक्त संग्रह ट्यूब में रखें, और सीरम एकत्र करने के लिए 2 मिनट के लिए 7,600 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। किसी भी वांछित साइटोकिन या मेटाबोलाइट के बाद के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सेरा को सहेजें।
  4. फेफड़ों का संग्रह
    1. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, उजागर पसली पिंजरे के किनारों को काट दें और धीरे से पसलियों को माउस के सिर की ओर खींचें ताकि दिल को उजागर किया जा सके। पीबीएस के साथ प्रीफिल किए गए 10 एमएल सिरिंज से जुड़ी 25 ग्राम सुई को दाएं वेंट्रिकल में डालें और धीरे-धीरे फैलना शुरू करें। सफल छिड़काव के संकेतक के रूप में फेफड़ों के विरंजन की तलाश करें। फुफ्फुसीय ऊतक को तोड़ने से बचने के लिए धीरे-धीरे फ्लश करें।
    2. बल के साथ दिल को उठाएं और फेफड़ों और हृदय को अलग करने के लिए एक कटौती करें। एक बार अलग होने के बाद, फेफड़ों के सभी लोबों को बल के साथ उठाएं और किसी भी अवशिष्ट रक्त को हटाने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ एक पकवान में कुल्ला करें। पेट्री डिश में, फेफड़ों को छोटे टुकड़ों में काट लें और अच्छी तरह से मिलाएं। बैक्टीरियल सीएफयू या वायरल पीएफयू के निर्धारण के लिए फेफड़ों के मिश्रण का आधा हिस्सा निकालें और इसे होमोजेनाइजेशन के लिए 0.5 एमएल पीबीएस के साथ प्रीफिल किए गए गोल तल 15 एमएल ट्यूब में रखें।
      नोट: विभिन्न आकलनों के लिए एक ही फेफड़े के अलग-अलग लोब नहीं लेना महत्वपूर्ण है। इसके बजाय, सभी लोबों को एक साथ अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए, और विभिन्न आकलनों के लिए समान रूप से पार्स किया जाना चाहिए।
    3. फ्लो साइटोमेट्री (नीचे अनुभाग 7) के लिए फेफड़े के दूसरे आधे हिस्से को हटा दें और इसे आरपी -10 के 0.5 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से भरे हुए गैर-ऊतक संस्कृति-उपचारित 24-वेल प्लेट में रखें। प्रसंस्करण तक कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
  5. नासोफैरिंक्स संग्रह
    1. गर्दन पर, फर को काटने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें, और फिर मांसपेशियों को काट दें और श्वासनली को उजागर करें।
      नोट: श्वासनली मांसपेशियों के नीचे स्थित एक ट्यूब जैसी संरचना है।
    2. इसे स्थिर करने के लिए माउस के जबड़े से 1 सेमी की दूरी पर श्वासनली के नीचे छोटे बल रखें। विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, धीरे से श्वासनली के पूर्ववर्ती हिस्से पर 0.1 सेमी स्लिट बनाएं, श्वासनली को पूरी तरह से काटने से बचें।
    3. 25 ग्राम सुई से जुड़े 0.58 मिमी टयूबिंग के साथ 0.5 एमएल पीबीएस से भरा 1 एमएल सिरिंज तैयार करें। नासोफैरिंक्स की ओर ऊपर की ओर जाने वाली श्वासनली में टयूबिंग डालकर नाक धोने को इकट्ठा करें। एक बार जब प्रतिरोध नाक गुहा में प्रवेश करने का अनुभव होता है, तो नाक पर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें और धीरे-धीरे नाक के लैवेज को इकट्ठा करने के लिए श्वासनली के माध्यम से पीबीएस को फ्लश करें।
    4. माउस को एक प्रवण स्थिति में रखें। इथेनॉल के साथ माउस के सिर को स्प्रे करें। माउस के सिर की हड्डी को उजागर करने के लिए फर और मायस्टेशियल पैड को काटने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।
    5. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, जबड़े के किनारों और आंखों के बीच 1 सेमी की कटौती करें। बल का उपयोग करके, नाक गुहा को उजागर करने के लिए चेहरे की हड्डियों को धीरे-धीरे शरीर से दूर खींचें।
    6. नाक के ऊतकों को धीरे से हटाने के लिए बल का उपयोग करें और इसे होमोजेनाइजेशन के लिए पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ एक गोल तल ट्यूब में रखें।
  6. एकत्रित ऊतक को समरूप बनाने के लिए, पहले होमोजेनाइज़र जांच को 70% इथेनॉल में डालकर साफ करें और 30 सेकंड के लिए 60% शक्ति पर होमोजेनाइज़र चालू करें। 10 सेकंड के लिए बाँझ पानी में चरण दोहराएं। प्रत्येक ऊतक को 1 मिनट के लिए समरूप करें। प्रत्येक नमूने के बीच बाँझ पानी में और प्रत्येक अंग और नमूना समूह के बीच 70% इथेनॉल की एक ताजा ट्यूब में होमोजेनाइज़र जांच को साफ करें।
  7. जीवाणु संख्याओं की गणना
    1. एक बार जब सभी अंगों को काट लिया जाता है और समरूप किया जाता है, तो रक्त एगर प्लेटों पर प्लेट सीरियल तनुकरण होता है। कुल सीएफयू की गणना करने के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए एमएल में अंतिम मात्रा को प्लेट और नोट करने के लिए 10 μL का उपयोग करें। रक्त एगर प्लेटों पर नासोफैरिंक्स नमूनों को 3 μg / mL gentamicin के साथ पूरक करें ताकि एस निमोनिया के विकास के लिए चयन किया जा सके, जबकि उस ऊतक को उपनिवेशित करने वाले अन्य सूक्ष्मजीवों के विकास को रोका जा सके। 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. फेफड़े और नासोफैरिंक्स के लिए जीवाणु सीएफयू की गणना करने के लिए, पहले रक्त एगर प्लेटों पर कॉलोनियों की गणना करें। फिर, प्रति एमएल और कुल संख्या की मात्रा की गणना करने के लिए समीकरण (1) और समीकरण (2) का उपयोग करें।
      प्रति एमएल राशि = कमजोर पड़ने वाले कारक × कॉलोनियों की संख्या 100 (1) ×
      कुल संख्या = प्रति नमूना कुल मात्रा × प्रति एमएल की मात्रा (2)
      नोट: समीकरण (1) में, 100 का उपयोग गुणा करने के लिए किया जाता है क्योंकि 10 μL चढ़ाया जाता है, जो 1 mL का 100 गुना कमजोर पड़ना है। समीकरण (2) में प्रति नमूना कुल मात्रा चरण 6.7.1 से है, जिसके परिणामस्वरूप प्रति अंग 100 का पता लगाने की सीमा होती है।
    3. बैक्टीरियल सीएफयू की गणना करने के लिए, बैक्टेरेमिया के लिए, पहले रक्त एगर प्लेटों पर कॉलोनियों की गिनती करें। फिर, रक्त के प्रति एमएल की मात्रा निर्धारित करने के लिए समीकरण (3) का उपयोग करें।
      रक्त की प्रति एमएल मात्रा = कमजोर पड़ने वाले कारक × कॉलोनियों की संख्या 100 × 10 (3) ×
      नोट: समीकरण (3) में, 100 का उपयोग 10 μL के रूप में किया जाता है, जो 1 mL का 100 गुना कमजोर पड़ने है, और 10 थक्कारोधी में रक्त के 1: 10 कमजोर पड़ने को इंगित करता है। इसके परिणामस्वरूप 1,000/एमएल का पता लगाने की सीमा होती है।

7. फ्लो साइटोमेट्री के लिए फेफड़ों के नमूनों का प्रसंस्करण

  1. निम्नानुसार आवश्यक मीडिया तैयार करें:
    1. चरण 2.1 में वर्णित आरपी -10 तैयार करें।
    2. आरपी -10 को 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज और 30 μL / mL DNase I के साथ मिलाकर पाचन बफर तैयार करें।
    3. एनएच4सीएल के 8.29 ग्राम, एनएएचसीओ3 के 1 ग्राम और ईडीटीए के 0.038 ग्राम को एच2ओ के 1 एल में भंग करके लाइसिस बफर तैयार करें।
    4. 450 एमएल एचबीएसएस को 50 एमएल हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस और 5 ग्राम सोडियम एजाइड के साथ मिलाकर 10x FACS बफर तैयार करें।
    5. 450 एमएल एचबीएसएस में 10x FACS बफर के 50 mL को पतला करके 1x FACS बफर तैयार करें।
  2. चरण 6.4.3 से फेफड़ों के नमूने लें और 24-वेल प्लेट में रखें। प्रत्येक कुएं में 500 μL पाचन बफर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर 45 मिनट से 1 घंटे तक इनक्यूबेट करें।
  3. आरपी -10 के 5 एमएल के साथ प्रत्येक नमूने के लिए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों को प्रीफिल करें। जब इनक्यूबेशन समाप्त हो जाता है, तो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर 100 μm फ़िल्टर रखें और इसे 1 एमएल आरपी -10 के साथ गीला करें।
  4. पी -1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, पचे हुए फेफड़ों को स्थानांतरित करें और उन्हें फ़िल्टर पर रखें। अंग को मैश करने के लिए 3 एमएल सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करें। हर बार आरपी -10 के 1 एमएल के साथ 2 एक्स कुल्ला करें।
  5. नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस और 327 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए घुमाएं। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और 1 एमएल लाइसिस बफर में गोली को फिर से निलंबित करें। लाल रक्त कोशिकाओं के लाइसिस की अनुमति देने के लिए 3 मिनट के लिए छोड़ दें। आरपी -10 के 5 एमएल के साथ बेअसर करें।
  6. नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस और 327 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए घुमाएं। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, आरपी -10 के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, और नमूनों की गिनती के लिए 10 μL लें।
  7. नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस और 327 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए घुमाएं। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और आरपी -10 में 2 × 106-4 × 106 कोशिकाओं / एमएल पर गोली को फिर से निलंबित करें। चरण 7.9, तालिका 5 और तालिका 6 में सूचीबद्ध वांछित सेल प्रकार 23 के लिए दाग लगाने के लिएप्रत्येक नमूने के 60 μL को 96-वेल प्लेट में जोड़ें।
  8. प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस और 327 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए घुमाएं।
  9. इस बीच, वांछित एंटीबॉडी के साथ एंटीबॉडी मास्टर मिक्स, फ्लोरेसेंट माइनस वन (एफएमओ), और सिंगल-स्टेन कंट्रोल तैयार करें। पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स (पीएमएन), मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स, डेंड्राइटिक कोशिकाओं और टी कोशिकाओं के लिए दाग लगाने के लिए, तालिका 5 और तालिका 6 में सूचीबद्ध एंटीबॉडी और अंतिम कमजोर पड़ने का उपयोग करें। एंटीबॉडी मिश्रण की कुल मात्रा 100 μL / वेल का उपयोग करें। मास्टर मिश्रण की उचित मात्रा और आवश्यक व्यक्तिगत एंटीबॉडी का निर्धारण करने के लिए तालिकाओं में सूचीबद्ध कमजोर पड़ने का पालन करें।
  10. जब स्पिन (चरण 7.8) किया जाता है, तो सतह पर तैरने वाले को अलग करें, एंटीबॉडी मिश्रण, एफएमओ, या सिंगल-स्टेन नियंत्रण के 100 μL में छर्रों को फिर से निलंबित करें, और अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  11. कुओं में 150 μL FACS बफर जोड़कर कोशिकाओं को 2x धोएं और प्लेट को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 327 × ग्राम पर घुमाएं।
  12. जब स्पिन किया जाता है, तो सतह पर तैरने वाले को अलग करें, छर्रों को 100 μL निर्धारण बफर में फिर से निलंबित करें, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  13. कुओं में 150 μL FACS बफर जोड़कर कोशिकाओं को 2x धोएं और प्लेट को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 327 × ग्राम पर घुमाएं।
  14. एफएसीएस बफर के 200 μL के साथ लेबल किए गए FACS ट्यूब तैयार करें। एफएसीएस बफर के 150 μL में छर्रों को फिर से निलंबित करें। व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक नमूने को 100 μm फ़िल्टर का उपयोग करके उनके संबंधित FACS ट्यूब में फ़िल्टर करें। बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और विश्लेषण करने के लिए तैयार होने तक प्रकाश से सुरक्षित रहें।
  15. प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

8. आईएवी की गणना के लिए पट्टिका परख

  1. निम्नानुसार आवश्यक मीडिया तैयार करें:
    1. 2.5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को 40 एमएल डीएमईएम में घोलकर संक्रमण माध्यम तैयार करें, जबकि घुलने तक 10-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। डीएमईएम के 460 एमएल में फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें।
    2. तरल सेटिंग पर 1.2 मिलीग्राम माइक्रोक्रिस्टलाइन सेल्यूलोज को 50 एमएल एच 2 ओ में घोलकर2.4% माइक्रोक्रिस्टलाइन सेल्यूलोज तैयार करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    3. 10-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाते हुए 2.5 ग्राम बीएसए को 40 एमएल डीएमईएम में घोलकर बीएसए डीएमईएम का 5% तैयार करें। 50 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए डीएमईएम के शेष 10 एमएल जोड़ें। फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. 5% बीएसए डीएमईएम के 1 एमएल को 2x MEM के 9 mL के साथ मिलाकर 2x MEM/0.5% बीएसए तैयार करें।
    5. 2.4% माइक्रोक्रिस्टलाइन सेल्यूलोज और 2x MEM/0.5% बीएसए के 1: 1 अनुपात को 1 मिलीग्राम / एमएल टीपीसीके (काइमोट्रिप्सिन का अवरोधक) ट्रिप्सिन के साथ मिलाकर कम चिपचिपाहट वाले ओवरले माध्यम तैयार करें।
    6. ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (ईएमईएम) के 450 एमएल को 50 एमएल हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस के साथ मिलाकर ईएमईएम / 10% एफबीएस तैयार करें।
  2. मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी (एमडीसीके) सेल लाइन विकसित करें। टी -25 ऊतक संस्कृति-उपचारित फ्लास्क में एक खरीदी गई शीशी से कोशिकाओं को ईएमईएम / 10% एफबीएस के 5 एमएल में जोड़ें। 3-5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 100% संगम तक न पहुंच जाएं। चरण 2.3 में दिए गए अनुसार सामंजस्य की जाँच करें।
  3. संस्कृति माध्यम को हटा दें और छोड़ दें, और कमरे के तापमान पीबीएस के 5 एमएल के साथ 2 गुना कुल्ला करें। फ्लास्क में ट्रिप्सिन-ईडीटीए का 1 एमएल जोड़ें और 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं अलग न हो जाएं। एक बार उठाने के बाद, 2 से 105 कोशिकाओं / एमएल पर सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ईएमईएम / 10% एफबीएस के 4 एमएल × साथ बेअसर करें।
  4. पट्टिका परख शुरू करने से 1 दिन पहले प्रति कुएं (2 से 105 कोशिकाओं / कुएं पर) 1 एमएल पुन: निलंबित कोशिकाओं × को जोड़कर 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेट में एमडीसीके कोशिकाओं को बीज दें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं उपयोग करने से पहले 100% कंफ्लुएंसी तक पहुंचती हैं और यदि आवश्यक हो तो लंबे समय तक इनक्यूबेट करती हैं।
  5. मानकों के रूप में उपयोग के लिए, चरण 8.1.1 में सूचीबद्ध संक्रमण माध्यम में आईएवी स्टॉक (एक ज्ञात टिटर का) के10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने (106-10 1) बनाएं। तीन प्रतियों में परीक्षण करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने का 1.2 एमएल बनाएं।
  6. बर्फ पर अंग होमोजेनेट्स को पिघलाएं। 2,000 × ग्राम पर टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज पर स्पिन करें और स्पष्ट सतह पर तैरने वाला एकत्र करें।
  7. चरण 8.5 को दोहराएं लेकिन चरण 8.6 में नमूने से सतह पर तैरने वाले के साथ।
  8. कोशिकाओं से माध्यम को एस्पिरेट करें और सभी एफबीएस को हटाने के लिए पीबीएस के 1 एमएल के साथ 2 एक्स धोएं।
  9. प्रत्येक मानक तनुकरण या क्रमिक रूप से पतला नमूने के 300 μL को प्रत्येक कुएं के किनारे धीरे से जोड़ें, उच्चतम कमजोर पड़ने से लेकर सबसे कम तक, और इसे तीन प्रतियों में करें।
  10. प्लेटों को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर रखें, प्लेट को कुल 50 मिनट के लिए हर 10 मिनट में हिलाएं। सुनिश्चित करें कि उन्हें इनक्यूबेटर में सपाट रखें और उन्हें ढेर न करें।
  11. 50 मिनट के बाद, कोशिकाओं को 1 एमएल पीबीएस के साथ 2x धो लें।
  12. सबसे कम कमजोर पड़ने और नो-वायरस कुओं को छोड़कर प्रत्येक कुएं में कम चिपचिपाहट वाले ओवरले माध्यम के 2 एमएल जोड़ें; उनमें, संक्रमण माध्यम और ट्रिप्सिन जोड़ें।
  13. प्लेट को 2-4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में वापस रखें ताकि सजीले टुकड़े प्राप्त किए जा सकें जिन्हें नग्न आंखों द्वारा देखा जा सकता है।
  14. प्लेटों को प्रत्येक अच्छी तरह से 2 एमएल पीबीएस को साइड से तेजी से जोड़कर धोएं और धीरे से हिलाएं ताकि स्थापित कम चिपचिपाहट वाले ओवरले माध्यम को निलंबित किया जा सके।
  15. माध्यम को धीरे-धीरे बंद करके कुएं में पूरे तरल की मात्रा को छोड़ दें।
  16. प्रत्येक कुएं में 2 एमएल पीबीएस के साथ एक बार और धोने को दोहराएं, और फिर कोमल पाइपिंग द्वारा पूरे तरल मात्रा को त्याग दें।
  17. सजीले टुकड़े को ठीक करने के लिए, प्रत्येक कुएं में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 μL जोड़ें, हिलाएं, और 30 मिनट के लिए बैठने दें।
  18. पीबीएस के 1 एमएल के साथ धीरे-धीरे धोएं; फिर, धीरे से तरल को छोड़ दें।
  19. सेल मोनोलेयर को कवर करने के लिए प्रत्येक कुएं में 1% क्रिस्टल वायलेट (पानी में पतला) का 500 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  20. 1 एमएल नल के पानी से धो लें। कोमल पाइपिंग द्वारा कुएं में सभी तरल को त्यागना सुनिश्चित करें। प्लेट को रात भर सूखने के लिए डायपर पैड पर उल्टा रखें।
  21. सजीले टुकड़े को नेत्रहीन रूप से गिनें और छवियों को किसी भी उपलब्ध इमेजर पर सहेजें।

Representative Results

बायोफिल्म-विकसित एस निमोनिया (चित्रा 1 ए) का उपयोग चूहों (चित्रा 1 बी) को संक्रमित करने के लिए किया गया था, जिसमें एक छोटे से 10 μL इनोकुलम का उपयोग किया गया था जो बिना एनेस्थेटाइज्ड चूहों को इंट्रानेसल रूप से वितरित किया गया था। इस छोटी मात्रा वाले इनोकुलम के परिणामस्वरूप प्रणालीगत प्रसार (चित्रा 2 बी, सी, + एसपी समूह) से बचते हुए नासोफेरिंक्स (चित्रा 2 ए, + एसपी समूह) तक सीमित लगातार न्यूमोकोकल गाड़ी होती है। इंट्रानेजल टीकाकरण के दो दिन बाद, चूहों को म्यूरिन-अनुकूलित एच 1 एन 1 इन्फ्लूएंजा ए वायरस ए / पीआर / 8/34 (आईएवी) 22,30 से संक्रमित किया गया था, जो नासोफेरिंक्स और फेफड़ों 23 के लिए विशिष्ट मात्रा में लगातार वितरण प्राप्त करने के लिए इंट्रानेसल और इंट्राट्रेचल दोनों में वितरित कियागया था।

यहां, मॉडल का उपयोग चूहों में वायरल संक्रमण के बाद बीमारी के पाठ्यक्रम की तुलना करने के लिए किया गया था, जिसमें टीआईजीआर 4 और डी 39 सहित एस निमोनिया के विभिन्न उपभेदों के साथ इंट्रानेसल रूप से चुनौती दी गई थी, जो आक्रामक उपभेद हैं जिनके परिणामस्वरूप निमोनिया होता है जो बैक्टेरेमिया में प्रगति करता है, और ईएफ 3030, जो एक ओटिटिस मीडिया स्ट्रेन 21,24,25,26,31 है। आईएवी सह-संक्रमित चूहों में रोग प्रस्तुति जीवाणु तनाव (चित्रा 2) पर निर्भर थी। जबकि किसी भी उपभेदों के बीच नासोफैरिंक्स (चित्रा 2 ए) की जीवाणु संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, एस निमोनिया टीआईजीआर 4 और डी 39, लेकिन ईएफ 3030 नहीं, आईएवी संक्रमण के बाद 48 घंटे तक फेफड़ों में फैल गया (चित्रा 2 बी)। एस निमोनिया टीआईजीआर 4 से संक्रमित चूहों में से चालीस प्रतिशत ने फेफड़ों में जीवाणु प्रसार प्रदर्शित किया, और उनमें से आधे बैक्टेरेमिक (चित्रा 2 सी) बन गए, जो पूर्वनिष्कर्षों 23 के अनुरूप थे।

एस निमोनिया डी 39 से संक्रमित चूहों ने अधिक कुशल प्रसार दिखाया, क्योंकि सह-संक्रमित चूहों के 100% में फेफड़ों में प्रसार देखा गया था (चित्रा 2 बी)। एस निमोनिया टीआईजीआर 4 के समान, उनमें से आधे ने बैक्टेरेमिया का अनुभव किया (चित्रा 2 सी)। समग्र अस्तित्व को ट्रैक करने में, बैक्टीरियल स्ट्रेन की परवाह किए बिना, सह-संक्रमित चूहों के जीवित रहने की दर उन चूहों की तुलना में काफी कम थी, जिन्हें परीक्षण किए गए सभी उपभेदों के लिए अकेले एस निमोनिया के साथ चुनौती दी गई थी (चित्रा 2 डी)। अकेले आईएवी के साथ चुनौती देने वाले नियंत्रण चूहों की तुलना में, एस निमोनिया टीआईजीआर 4 और डी 3 9 से संक्रमित चूहों ने बीमारी की त्वरित दर प्रदर्शित की। आईएवी संक्रमण के बाद दूसरे दिन तक, 30% (डी 39) और 20% (टीआईजीआर 4) चूहों ने दम तोड़ दिया था, जबकि आईएवी-केवल नियंत्रण समूहों ने चुनौती के बाद 5 वें दिन तक दम तोड़ना शुरू नहीं किया था (चित्रा 2 डी)। एस निमोनिया ईएफ 3030 और आईएवी से सह-संक्रमित चूहों में लक्षणों में देरी हुई थी, जो आईएवी-केवल नियंत्रण (चित्रा 2 डी) के समान थे। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि सह-संक्रमण मॉडल युवा स्वस्थ चूहों में बीमारी का परिणाम है जो जीवाणु तनाव-निर्भर है, जो रोग की प्रगति के प्रत्येक चरण में आवश्यक जीवाणु कारकों की खोज के लिए आदर्श बनाता है।

इस मॉडल का उपयोग फेफड़ों में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति का आकलन करने के लिए किया गया था (चित्रा 3 में सेल प्रकार और गेटिंग रणनीति) चूहों में आईएवी संक्रमण के बाद इंट्रानेसल रूप से एस निमोनिया के विभिन्न उपभेदों के साथ टीका लगाया गया था। जीवाणु उपभेदों डी 39 और टीआईजीआर 4, जो आईएवी संक्रमण के बाद फेफड़ों में फैल गए, ने परिसंचरण से भड़काऊ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह में बेसलाइन (असंक्रमित) से ऊपर एक महत्वपूर्ण वृद्धि प्राप्त की, जैसे कि न्यूट्रोफिल (पीएमएन) और मोनोसाइट्स, जबकि ईएफ 3030 नहीं था (चित्रा 4 ए-सी)। अकेले आईएवी संक्रमण ने वायरल संक्रमण के खिलाफ मेजबान रक्षा के लिए महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह में बेसलाइन से ऊपर एक महत्वपूर्ण वृद्धि प्राप्त की, जैसे कि एनके कोशिकाएं और गामा-डेल्टा टी कोशिकाएं (चित्रा 4 ए-सी)। वायरल चुनौती (चित्रा 4 ए-सी) से पहले एस निमोनिया से संक्रमित चूहों में इन एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं को काफी कम कर दिया गया था। यह साइटोकिन प्रतिक्रियाओं का आकलन करने वाले पूर्व अध्ययनों के अनुरूप है जिसमें पाया गया कि एस निमोनिया कैरिज ने टाइप 1 इंटरफेरॉन के उत्पादन को कम कर दियाऔर फेफड़ों में आईएवी भार को नियंत्रित करने के लिए मेजबान की क्षमता को खराब कर दिया। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि सह-संक्रमण मॉडल का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है कि मोनो बनाम पॉलीमाइक्रोबियल संक्रमण में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं कैसे बदलती हैं।

इस मॉडल का उपयोग एस निमोनिया टीआईजीआर 4 से संक्रमित चूहों में आईएवी संक्रमण के बाद बीमारी के पाठ्यक्रम पर उम्र बढ़ने के प्रभाव का आकलन करने के लिए भी किया गया था। अकेले संक्रमित चूहों में, वायरल टिटर्स युवा और वृद्ध समूहों (चित्रा 5 ए) 23 के बीच भिन्न नहीं थे। जैसा कि पूर्व अध्ययन23 में, पुराने चूहों ने अपने युवा समकक्षों की तुलना में बीमारी के पहले और काफी अधिक गंभीर संकेत प्रदर्शित किए, जैसा कि उच्च नैदानिक स्कोर (चित्रा 5 बी) द्वारा प्रदर्शित किया गया है। रोग के लक्षणों के अनुरूप, एस निमोनिया के साथ टीका लगाए गए पुराने चूहों ने आईएवी संक्रमण के बाद 24 घंटे के भीतर तेजी से मरना शुरू कर दिया, और उन सभी ने बीमारी के कारण दम तोड़ दिया, जबकि युवा नियंत्रण काफी अधिक (33%) दर पर संक्रमण से बच गए (चित्रा 5 सी)। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि सह-संक्रमण मॉडल का उपयोग कमजोर मेजबानों में अधिक गंभीर बीमारी का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जिससे यह मेजबान कारकों की खोज के लिए आदर्श हो जाता है जो सह-संक्रमण के लिए प्रतिरोध या संवेदनशीलता प्रदान करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: प्रतिरक्षा कोशिका प्रवाह और रोगज़नक़ बोझ के आकलन के लिए सह-संक्रमण और अंग प्रसंस्करण की समयरेखा। (A) स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया बायोफिल्म में उगाए जाते हैं। (ख) चूहों को संकेतित बायोफिल्म-विकसित एस. निमोनिया स्ट्रेन के 5 × 106 सीएफयू के साथ इंट्रानेसल रूप से टीका लगाया जाता है ताकि नासोफैरेन्जियल कैरिज स्थापित किया जा सके या अनुपचारित छोड़ दिया जा सके। अड़तालीस घंटे बाद, चूहों को या तो पीबीएस के साथ नकली इलाज किया जाता है या इन्फ्लूएंजा ए वायरस पीआर 8 के 200 पीएफयू इंट्रानेसल और 20 पीएफयू इंट्राट्रैकिल रूप से प्राप्त होते हैं। नैदानिक रोग स्कोर और जीवित रहने के लिए चूहों की समय के साथ निगरानी की जाती है। (सी) आईएवी संक्रमण के बाद 48 घंटे में, विभिन्न अंगों में बैक्टीरियल सीएफयू या वायरल पीएफयू या फेफड़ों में प्रतिरक्षा कोशिका प्रवाह का आकलन किया जाता है। संक्षेप: सीएफयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां; पीएफयू = पट्टिका बनाने वाली इकाइयाँ; आईएवी = इन्फ्लूएंजा ए वायरस पीआर 8; आईटी = इंट्राट्रैकली; एनपी = नासोफैरेन्जीली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एस निमोनिया-टीकाकृत चूहों के दोहरे इंट्रानेजल / इंट्राट्राचेल आईएवी संक्रमण से जीवाणु प्रसार और बीमारी होती है जो जीवाणु तनाव पर निर्भर होती है। युवा (10-12 सप्ताह की उम्र) नर C57BL/6 (B6) चूहे चित्र 1 के अनुसार संक्रमित थे। (ए) नासोफैरिंक्स, (बी) फेफड़ों और (सी) रक्त में जीवाणु संख्या सभी आईएवी संक्रमण के बाद 48 घंटे में निर्धारित की गई थी। (बी, सी) प्रतिशत चूहों के अंश को दर्शाता है जो प्रसार का प्रदर्शन करते हैं। (घ) आईएवी संक्रमण के बाद 10 दिनों तक उत्तरजीविता की निगरानी की गई। (A, B) n = 5, (C) n = 11, और (D) n = 6 चूहों प्रति समूह से एकत्रित डेटा दिखाया गया है। प्रत्येक सर्कल एक माउस से मेल खाता है, और डैश ्ड लाइनें पहचान की सीमा को इंगित करती हैं। (ए-सी) *, क्रुस्कल-वालिस परीक्षण द्वारा निर्धारित संकेतित समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर (पी < 0.05) को इंगित करता है। (डी) *, लॉग-रैंक (मेंटल-कॉक्स) परीक्षण द्वारा निर्धारित प्रति जीवाणु तनाव + एसपी और को-इनफ चूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर (पी < 0.05) को इंगित करता है। संक्षेप: +एसपी = चूहों को केवल संकेतित तनाव का उपयोग करके बैक्टीरिया के साथ इंट्रानेसल रूप से संक्रमित किया गया; सह-इनफ = जीवाणु-संक्रमित चूहे जो आईएवी से संक्रमित थे; आईएवी = चूहे जिन्हें इन्फ्लूएंजा ए वायरस प्राप्त हुआ; सीएफयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिरक्षा सेल गेटिंग रणनीति। फेफड़ों को काटा गया था, और प्रतिरक्षा कोशिका प्रवाह प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था। विभिन्न सेल प्रकारों की प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति दिखाई गई है। (ए) सीडी 45 +, जीवित एकल कोशिकाओं को गेट किया गया था और (बी) पीएमएन (एलवाई 6 जी +, सीडी 11 बी +), मैक्रोफेज (एलवाई 6 जी-, एलवाई 6 सी -, एफ 480 +), और मोनोसाइट्स (एलवाई 6 जी -, एलवाई 6 सी +), (सी) डीसी (एलवाई 6 जी -, सीडी 11 सी +) और एनके कोशिकाओं (एनके 1.1 +, सीडी 3-), (डी) टीसीआर -11 और सीडी 8 (सीडी 8 + ) और सीडी 8 (सीडी 8 + ) के प्रतिशत ) टी कोशिकाओं का निर्धारण किया गया था। संक्षेप: एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एसएससी-डब्ल्यू = साइड स्कैटर-पीक चौड़ाई; L/D = जीवित/मृत; एफएमओ = फ्लोरोसेंट माइनस एक; एनके = प्राकृतिक हत्यारा; पीएमएन = पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट; डीसी = डेंड्राइटिक सेल; टीसीआर = टी सेल रिसेप्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं जीवाणु तनाव-निर्भर हैं। युवा (10-12 सप्ताह के) सी 57बीएल /6 नर चूहों को या तो असंक्रमित किया गया था, संकेतित स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया स्ट्रेन (+एसपी) के साथ अकेले टीका लगाया गया था, आईएवी (आईएवी) के साथ अकेले चुनौती दी गई थी, या एस निमोनिया और आईएवी (को-इनफ) से सह-संक्रमित थे। आईएवी संक्रमण के अड़तालीस घंटे बाद ( चित्रा 1 में प्रयोगात्मक डिजाइन देखें), फेफड़ों की कटाई की गई थी, और प्रतिरक्षा कोशिका प्रवाह को चित्रा 3 में गेटिंग रणनीति के बाद फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था। (ए) सीडी 45 गेट के भीतर प्रत्येक इंगित सेल प्रकार का औसत प्रतिशत गर्मी मानचित्र पर सभी उपचार समूहों के लिए प्रदर्शित किया जाता है। (बी) सेल प्रकारों के प्रतिनिधि डॉट प्लॉट जो उपचार के बीच महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित करते हैं, प्रत्येक माउस समूह के लिए दिखाए जाते हैं। (सी) संकेतित प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों का प्रतिशत दिखाया गया है। प्रत्येक सर्कल एक माउस से मेल खाता है। (ए, सी) प्रति समूह एन = 5 चूहों से पूल किए गए डेटा दिखाए गए हैं। *, को-इनफ और असंक्रमित के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर (पी < 0.05) को इंगित करता है; $, आईएवी और असंक्रमित के बीच एक महत्वपूर्ण इंगित करता है; #, अकेले Co-inf और IAV के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए चुनौती समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर एनोवा द्वारा निर्धारित किए गए थे, जिसके बाद टुकी का परीक्षण किया गया था। संक्षेप: एनके = प्राकृतिक हत्यारा; पीएमएन = पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट; डीसी = डेंड्राइटिक सेल; टीसीआर = टी सेल रिसेप्टर; आईएवी = इन्फ्लूएंजा ए वायरस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: उम्र बढ़ने और आईएवी / स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया सह-संक्रमण के लिए मेजबान संवेदनशीलता में वृद्धि। युवा (10-12 सप्ताह) और आयु वर्ग (21-22 महीने) सी 57बीएल /6 नर चूहों को एस निमोनिया टीआईजीआर 4 यानी और आईएवी यानी और ( जैसा कि चित्रा 1 में) के साथ सह-संक्रमित किया गया था या अकेले आईएवी के साथ चुनौती दी गई थी। (ए) वायरल टिटर्स 48 घंटे बाद निर्धारित किए गए थे। तारांकन सांख्यिकीय महत्व (पी < 0.05) को इंगित करता है जैसा कि छात्र के टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित किया गया है। डेटा प्रति समूह एन = 4 चूहों से एकत्र किया जाता है। (बी) नैदानिक स्कोर और (सी) उत्तरजीविता की समय के साथ निगरानी की गई। (बी) एन = 6 चूहों प्रति समूह से पूल किए गए एसईएम ± औसत दिखाया गया है। तारांकन मैन-व्हिटनी परीक्षण द्वारा निर्धारित संकेतित समय बिंदु पर युवा बनाम पुराने चूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व (पी < 0.05) का संकेत देते हैं। (C) डेटा प्रति समूह n = 6 चूहों से एकत्र किया जाता है। तारांकन लॉग-रैंक (मेंटल-कॉक्स) परीक्षण द्वारा निर्धारित युवा बनाम पुराने चूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व (पी < 0.05) का संकेत देते हैं। संक्षेप: आईएवी = इन्फ्लूएंजा ए वायरस; यानी = इंट्रानेसल रूप से; यानी = इंट्राट्रैकियली; SEM = माध्य की मानक त्रुटि। चित्रा 5 ए को जोमा एट अल.23 की अनुमति से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सीडीएम के लिए मिक्स आई स्टॉक
ऐडिनीन 0.1 ग्राम
डी-अलानिन 0.25 ग्राम
CaCl2 निर्जल 0.025 ग्राम
मैंगनीज सल्फेट 0.03 ग्राम
साइनोकोबालमिन 10 mg/mL स्टॉक का 100 μL
पैरा-एमिनोबेंजोइक एसिड 5 mg/mL स्टॉक का 400 μL
पाइरिडोक्सामाइन 2एचसीएल 10 mg/mL स्टॉक का 100 μL
CDM के लिए मिक्स II स्टॉक
गुआनिन 0.05 ग्राम
यूरैसिल 0.05 ग्राम
CDM के लिए मिक्स III स्टॉक
फेरिक नाइट्रेट 9H2O 50 मिलीग्राम /
फेरिक सल्फेट 7 एच2ओ 10 मिलीग्राम /
CDM के लिए मिक्स IV स्टॉक
बीटा-निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड 25 मिलीग्राम /

तालिका 1: सीडीएम के लिए मिक्स I, II, III और IV स्टॉक। संक्षिप्त नाम: सीडीएम = रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया।

सीडीएम के लिए विटामिन मिक्स स्टॉक
पाइरिडोक्सल हाइड्रोक्लोराइड 0.8 ग्राम
थियामिन सीएल2 0.4 ग्राम
रिबोफ़्लाविन 0.4 ग्राम
Ca-pantothenate 0.4 ग्राम
बायोटिन 0.04 ग्राम
फोलिक एसिड 0.4 ग्राम
नियासिनमाइड 0.4 ग्राम

तालिका 2: सीडीएम के लिए विटामिन मिक्स स्टॉक। संक्षिप्त नाम: सीडीएम = रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया।

सीडीएम के लिए एमिनो एसिड स्टॉक
एल-एलानिन 0.480 ग्राम
L-Arginine 0.250 ग्राम
एल-शतावरी 0.700 ग्राम
एल-एस्पार्टिक एसिड 0.600 ग्राम
एल-सिस्टीन 1.000 ग्राम
एल-सिस्टीन 0.100 ग्राम
एल-ग्लूटामिक एसिड 0.200 ग्राम
एल-ग्लूटामाइन 0.780 ग्राम
L-Glycine 0.350 ग्राम
एल-हिस्टिडाइन 0.300 ग्राम
एल-आइसोल्यूसीन 0.430 ग्राम
एल-ल्यूसीन 0.950 ग्राम
एल-लाइसिन 0.880 ग्राम
एल-मेथिओनिन 0.250 ग्राम
एल-फेनिलएलनिन 0.550 ग्राम
L-Proline 1.350 ग्राम
L-Serine 0.680 ग्राम
L-Threonine 0.450 ग्राम
एल-ट्रिप्टोफैन 0.100 ग्राम
L-Valine 0.650 ग्राम

तालिका 3: सीडीएम के लिए एमिनो एसिड स्टॉक। संक्षिप्त नाम: सीडीएम = रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया।

CDM के लिए Starter Stock
Dextrose 1.0 ग्राम
मैग्नीशियम सल्फेट -7-हाइड्रेट 0.070 ग्राम
पोटेशियम फॉस्फेट डिबासिक 0.02 ग्राम
पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक 0.1 ग्राम
सोडियम एसीटेट निर्जल 0.45 ग्राम
सोडियम बाइकार्बोनेट 0.25 ग्राम
सोडियम फॉस्फेट डिबासिक 0.735 ग्राम
सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक 0.32 ग्राम
सीडीएम के लिए अंतिम पूरक
कोलीन क्लोराइड 0.1 ग्राम
एल-सिस्टीन एचसीएल 0.075 ग्राम
सोडियम बाइकार्बोनेट 0.25 ग्राम

तालिका 4: सीडीएम के लिए स्टार्टर स्टॉक और अंतिम पूरक। संक्षिप्त नाम: सीडीएम = रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया।

एंटीबॉडी/फ्लोरोफोरे क्लोन कमजोर पड़ने का कारक
यूवी उत्तेजना के लिए एल / डी N/A 0.38888889
Ly6G AF 488 1A8 0.25
CD11b APC M1/70 0.25
CD11c PE N418 0.18055556
माउस एफसी ब्लॉक 2.4G2 0.11111111
F4/80 PE Cy7 BM8 0.18055556
Ly6C BV605 AL-21 0.25
CD103 BV 421 M290 0.18055556
CD45 APC-eF-780 30-F11 0.18055556

तालिका 5: एंटीबॉडी पैनल 1.

एंटीबॉडी/फ्लोरोफोरे क्लोन कमजोर पड़ने का कारक
यूवी उत्तेजना के लिए एल / डी N/A 0.388888889
TCR-β APC Cy7 H57-597 0.180555556
CD4 V450 (प्रशांत ब्लू) RM4-5 0.25
CD8 BV650 53-6.7 0.180555556
माउस एफसी ब्लॉक 2.4G2 0.111111111
CD45 PE 30-F11 0.180555556
CD3 AF488 145-2C11 0.180555556
TCR- γΔ APC GL-3 0.180555556
NK1.1 AF 700 PK136 0.180555556

तालिका 6: एंटीबॉडी पैनल 2।

Discussion

आईएवी सह-संक्रमण प्रयोगात्मक अध्ययनों में से अधिकांश आईएवी से पूर्व-संक्रमित चूहों के फेफड़ों में जीवाणु वितरण पर भरोसा करते हैं। इन मॉडलों ने फुफ्फुसीय वातावरण और प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में परिवर्तन की पहचान करने में मदद की है जो मेजबान को द्वितीयक जीवाणु संक्रमण 15,16,17,32,33,34,35,36,37 के लिए अतिसंवेदनशील बनाते हैं। हालांकि, ये मॉडल एस निमोनिया के संक्रमण की नकल करने में विफल रहे हैं, जो एक स्पर्शोन्मुख कॉलोनाइजर से एक रोगज़नक़ में गंभीर फेफड़ों और प्रणालीगत संक्रमण पैदा करने में सक्षम है। इसके अलावा, ये मॉडल ऊपरी श्वसन पथ में मेजबान कारकों और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं जो संक्रमण के लिए संवेदनशीलता में योगदान करते हैं। आईएवी संक्रमण के बाद नासोफेरिंक्स से फेफड़ों तक न्यूमोकोकी के आंदोलन के लिए एक पूर्व मॉडल वायरल संक्रमण के बाद नासोफेरिंक्स के जीवाणु संक्रमण पर निर्भर था। हालांकि, यहमानव रोगियों में देखी गई बीमारी के गंभीर लक्षणों को पुन: उत्पन्न करने में विफल रहा। यहां वर्णित संशोधित मुराइन संक्रमण मॉडल एस निमोनिया के संक्रमण को स्पर्शोन्मुख गाड़ी से एक रोगज़नक़ में बदल देता है जो गंभीर नैदानिक बीमारी का कारण बनता है।

इस मॉडल का एक महत्वपूर्ण कदम नासोफैरिंक्स में एस निमोनिया संक्रमण स्थापित कर रहा है। स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया बायोफिल्म बनाते हैं और विभिन्न क्षमताओं21,38 पर नासोफैरिंक्स को उपनिवेशित करते हैं। लगातार संक्रमण स्थापित करने के लिए, अब तक परीक्षण किए गए बायोफिल्म-विकसित जीवाणु उपभेदों के कम से कम 5 × 106 सीएफयू की आवश्यकता होतीहै। यह अनुशंसा की जाती है कि वायरल संक्रमण से पहले नासोफैरिंक्स के स्थिर संक्रमण के लिए किसी भी नए जीवाणु तनाव का परीक्षण किया जाए। वायरल सह-संक्रमण के लिए, पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि नासोफैरिंक्स 21,22,23 से बैक्टीरिया के फैलाव के लिए आईएवी के साथ इंट्रानेसल संक्रमण की आवश्यकता होती है। उन पूर्व अध्ययनों में, इंट्रानेसल डिलीवरी के लिए आईएवी के 500 पीएफयू का उपयोग किया गया था, जबकि इस अध्ययन में, 200 पीएफयू नासोफेरिंक्स में जीवाणु संख्या बढ़ाने के लिए पर्याप्त थे। आईएवी संक्रमण ऊपरी वायुमार्ग तक सीमित नहीं है और फेफड़ों39,40 तक फैल सकता है, जो फुफ्फुसीय वातावरण को जीवाणु संक्रमण15,16,41 के लिए अधिक अनुमेय बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। फेफड़ों में आईएवी की डिलीवरी या तो इंट्रानेसल डिलीवरी या एनेस्थेटाइज्ड चूहों की इंट्राट्रैकियल स्थापना द्वारा प्राप्त की जा सकती है। बीएएलबी / सीबीवाईजे चूहों के साथ पूर्व कार्य में पाया गया कि इंट्रानेसल डिलीवरी के परिणामस्वरूप वायरल निमोनिया21 होता है; हालांकि, इंट्रानेजल टीकाकरण के बाद फेफड़ों तक इनोकुलम की पहुंच सी 57बीएल / 6 चूहों में अधिक प्रतिबंधित है। सी 57बीएल /6 चूहों में, वायरस23 के लगातार वितरण के लिए इंट्राट्रैकियल इंस्टॉलेशन की आवश्यकता होती है। इस मॉडल में, पूर्व जीवाणु उपनिवेश वायरल संक्रमण23 के बाद रोग के लक्षणों की प्रस्तुति में तेजी लाता है। चूंकि वायरल संक्रमण स्वयं कैनेटीक्स में संभावित भिन्नता के साथ रोग के लक्षण पैदा कर सकता है, इसलिए पहले परीक्षण किए गए किसी भी नए वायरल स्ट्रेन के लिए खुराक की एक श्रृंखला का परीक्षण करने और एक खुराक चुनने की सिफारिश की जाती है जो सह-संक्रमित मेजबानों में त्वरित कैनेटीक्स का खुलासा करती है।

फेफड़े इस मॉडल में रोग मूल्यांकन के लिए एक और महत्वपूर्ण रीडआउट प्रदान करते हैं। रोगज़नक़ बोझ और प्रतिरक्षा कोशिका प्रवाह के आकलन के लिए, एक ही माउस से एक फेफड़े का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि संक्रमण और सूजन की गंभीरता लोब के बीच भिन्न हो सकती है, इसलिए विभिन्न आकलनों के लिए एक ही फेफड़े के अलग-अलग लोब नहीं लेने की सिफारिश की जाती है। इसके बजाय, सभी लोबों को छोटे टुकड़ों में काटा जा सकता है, एक साथ अच्छी तरह से मिलाया जा सकता है, और फिर विभिन्न आकलनों के लिए समान रूप से पार्स किया जा सकता है। इसी तरह, नासोफैरिंक्स का उपयोग बैक्टीरियल सीएफयू या वायरल पीएफयू और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की गणना के लिए किया जा सकता है। हालांकि, धोने और ऊतक से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या एक ही समूह के भीतर चूहों से नमूने एकत्र किए बिना प्रवाह साइटोमेट्री करने के लिए बहुत कम है। वैकल्पिक रूप से, नासोफैरिंक्स में सूजन का मूल्यांकन हिस्टोलॉजिकल रूप से किया जा सकताहै।

इस मॉडल की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि यह रोगियों में देखी गई नैदानिक बीमारी को पुन: उत्पन्न करता है। मनुष्यों में, आईएवी संक्रमण के बाद द्वितीयक न्यूमोकोकल निमोनिया अक्सर बीमारी के स्पष्ट संकेत देता है, जिसमें खांसी, डिस्पेनिया, बुखार और मांसपेशियों में दर्द शामिल हैं जो अस्पताल में भर्ती होने, श्वसन विफलता और यहां तक कि मृत्यु का कारण बन सकते हैं। यह मॉडल चूहों द्वारा प्रदर्शित सांस लेने में कठिनाई (श्वास स्कोर में परिलक्षित) और समग्र अस्वस्थता (मुद्रा और आंदोलन स्कोर में परिलक्षित) के साथ-साथ कुछ स्वस्थ युवा नियंत्रणों में मृत्यु के संदर्भ में मनुष्यों में देखे गए नैदानिक रोग के गंभीर संकेतों को पुन: प्रस्तुत करता है। सह-संक्रमित चूहों में रोग के लक्षण ों में वृद्धि संभवतः फेफड़ों में जीवाणु प्रसार और न्यूमोकोकल कैरिज23 के साथ चूहों में बिगड़ा हुआ वायरल निकासी दोनों का परिणाम है। मॉडल की एक सीमा यह है कि नासोफैरिंक्स से नैदानिक रोग और जीवाणु प्रसार की घटना चूहों के बीच भिन्न होती है और बैक्टीरिया के तनाव, मेजबान आयु और जीनोटाइप21,22,23 से प्रभावित होती है। इसे दर्शाते हुए, आक्रामक उपभेदों के लिए, स्थानीय संक्रमण (बिना किसी पता लगाने योग्य बैक्टेरेमिया के साथ) से मृत्यु तक की प्रगति 24 घंटे के भीतर हो सकती है। इसलिए, प्रणालीगत प्रसार के सही मूल्यांकन के लिए, बैक्टेरेमिया का पालन कम अंतराल (हर 6-12 घंटे) पर किया जाना चाहिए। इसी तरह, रोग स्कोर तेजी से बदल सकता है, खासकर सह-संक्रमण के बाद पहले 72 घंटों में। इसलिए, रोग के लक्षणों को बारीकी से ट्रैक करने के लिए, आईएवी संक्रमण के बाद 1-3 दिनों के लिए प्रति दिन तीन बार चूहों की निगरानी करने की सलाह दी जाती है।

सारांश में, यह मॉडल नासोफेरिंक्स के स्पर्शोन्मुख कॉलोनाइजर से एक रोगज़नक़ तक एस निमोनिया के आंदोलन को दोहराता है जो आईएवी संक्रमण पर फुफ्फुसीय और प्रणालीगत बीमारी पैदा करने में सक्षम है। इस मॉडल में, आईएवी नासोफेरिंक्स में जीवाणु व्यवहार को संशोधित करने, फेफड़ों में जीवाणु प्रसार को बढ़ाने और जीवाणुरोधीप्रतिरक्षा को बदलने के माध्यम से एस निमोनिया के संक्रमण को ट्रिगर करता है। इसी तरह, बैक्टीरियल कैरिज एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कुंद करता है और फेफड़ों से आईएवी निकासी को बाधित करताहै। यह इस मॉडल को एकल बनाम पॉलीमाइक्रोबियल संक्रमणों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन को पार्स करने के लिए आदर्श बनाता है। इसके अतिरिक्त, सह-संक्रमण के बाद बीमारी का पाठ्यक्रम, आंशिक रूप से, नासोफेरिंक्स में मौजूद न्यूमोकोकी के तनाव पर निर्भर है। इसलिए, मॉडल एस निमोनिया के रोगजनक संक्रमण बनाम स्पर्शोन्मुख उपनिवेशीकरण के लिए आवश्यक जीवाणु कारकों को विच्छेदित करने के लिए उपयुक्त है। अंत में, यह मॉडल सह-संक्रमण के लिए उम्र बढ़ने की संवेदनशीलता को पुन: पेश करता है, और हालांकि यहां इसका परीक्षण नहीं किया गया था, इसका उपयोग रोग पाठ्यक्रम पर मेजबान पृष्ठभूमि के प्रभाव का आकलन करने के लिए आसानी से किया जा सकता है। अंत में, गाड़ी और बीमारी को अलग-अलग चरणों में अलग करना रोगजनकों और मेजबान दोनों के आनुवंशिक रूपों का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है, जिससे रोग की प्रगति के विभिन्न चरणों में मेजबान के साथ एक महत्वपूर्ण पैथोबियोनेट की बातचीत की विस्तृत परीक्षा की अनुमति मिलती है। आगे बढ़ते हुए, इस मॉडल का उपयोग कमजोर मेजबानों के लिए उपचार विकल्पों को तैयार करने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए निक लेनहार्ड को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम बैक्टीरियल उपभेदों के लिए एंड्रयू कैमिली और एंथोनी कैम्पागनरी और वायरल उपभेदों के लिए ब्रूस डेविडसन को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान (R21AG071268-01) द्वारा जेएल और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminobenzoic acid  Fisher AAA1267318 Mix I stock
96-well round bottom plates Greiner Bio-One 650101
100 µm Filters Fisher 07-201-432
Adenine Fisher AC147440250 Mix I stock
Avicel Fisher 501785325 Microcyrstalline cellulose 
BD Cytofix Fixation Buffer  Fisher BDB554655 Fixation Buffer
BD Fortessa Flow cytometer 
BD Intramedic Polyethylene Tubing  Fisher 427410 Tubing for nasal lavage
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL) Fisher 14-823-30
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure Fisher 02-675-185 Blood collection tubes
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide Fisher AAJ6233703 Mix IV stock
Biotin Fisher AC230090010 Vitamin stock
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000644 Mice used in this study
Calcium Chloride Anhydrous Fisher Chemical C77-500 Mix I stock
CD103 BV 421 BD Bioscience BDB562771 Clone: M290 DF 1:200
CD11b APC Invitrogen 50-112-9622 Clone: M1/70, DF 1:300
CD11c PE BD Bioscience BDB565592 Clone: N418 DF 1:200
CD3 AF 488 BD Bioscience OB153030 Clone: 145-2C11 DF 1:200
CD4 V450 BD Horizon BDB560470 Clone: RM4.5 DF 1:300
CD45 APC eF-780 BD Bioscience 50-112-9642 Clone: 30-F11 DF 1:200
CD45 PE Invitrogen 50-103-70 Clone: 30-F11 DF 1:200
CD8α BV 650 BD Horizon BDB563234 Clone: 53-6.7 DF 1:200
Choline chloride Fisher AC110290500 Final supplement to CDM
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems Fisher 09-761-107 Filter sterilzation apparatus 
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks Fisher 10-126-9
Corning Costar Clear Multiple Well Plates Fisher 07-201-590
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate Fisher MT10017CM
Cyanocobalamin Fisher AC405925000 Mix I stock
D39 National Collection of Type Culture (NCTC) NCTC 7466 Streptococcus pneumoniae strain
D-Alanine Fisher AAA1023114 Mix I stock
D-Calcium pantothenate Fisher AC243301000 Vitamin stock
Dextrose Fisher Chemical D16-500 Starter stock
Dnase  Worthington Biochemical  LS002147
Eagles Minimum Essential Medium ATCC 30-2003
EDTA VWR BDH4616-500G
EF3030 Center for Disease Control and Prevention  Available via the isolate bank request Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name
F480 PE Cy7 BD Bioscience 50-112-9713 Clone: BMB DF 1:200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 50 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap Fisher 14-959-11B 15 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL) Fisher 14-959-5 FACS tubes 
FBS Thermofisher 10437-028
Ferric Nitrate Nonahydrate Fisher I110-100 Mix III stock
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors Fisher 08-951-5 Instruments used for harvest
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops  Fisher 22-363-602 Inoculating loops 
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps Fisher 13-812-38 Forceps for harvest
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher 05-408-137 Micocentrifuge tubes
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL) Fisher 14-955-459
Folic Acid Fisher AC216630500 Vitamin stock
Gibco RPMI 1640 (ATCC) Fisher A1049101
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium Fisher 14190250
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red Fisher 14025134
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red Fisher 11-935-046
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher 15-140-122
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher 15-250-061
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher 25-200-056
Glycerol (Certified ACS) Fisher G33-4
Glycine Fisher AA3643530 Amino acid stock
Guanine Fisher AAA1202414 Mix II stock
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads Fisher 50-112-9040
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher AAA1517836 Mix III stock
L-Alanine Fisher AAJ6027918 Amino acid stock
L-Arginine Fisher AAA1573814 Amino acid stock
L-Asparagine Fisher AAB2147322 Amino acid stock
L-Aspartic acid  Fisher AAA1352022 Amino acid stock
L-Cysteine Fisher AAA1043518 Amino acid stock
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Fisher AAA1038914 Final supplement to CDM
L-Cystine Fisher AAA1376218 Amino acid stock
L-Glutamic acid  Fisher AC156211000 Amino acid stock
L-Glutamine Fisher O2956-100 Amino acid stock
L-Histidine Fisher AC166150250 Amino acid stock
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Invitrogen 50-112-1524 Clone: N/A DF 1:500
L-Isoleucine Fisher AC166170250 Amino acid stock
L-Leucine Fisher BP385-100 Amino acid stock
L-Lysine Fisher AAJ6222514 Amino acid stock
L-Methionine Fisher AAA1031822 Amino acid stock
Low endotoxin BSA  Sigma Aldrich A1470-10G
L-Phenylalanine Fisher AAA1323814 Amino acid stock
L-Proline Fisher AAA1019922 Amino acid stock
L-Serine Fisher AC132660250 Amino acid stock
L-Threonine Fisher AC138930250 Amino acid stock
L-Tryptophan Fisher AAA1023014 Amino acid stock
L-Valine Fisher AAA1272014 Amino acid stock
Ly6C BV 605 BD Bioscience BDB563011 Clone: AL-21 DF 1:300
Ly6G AF 488  Biolegend NC1102120 Clone: IA8, DF 1:300
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells  American Type Culture Collection (ATCC) CCL-34 MDCK cell line for PFU analuysis 
Magnesium Sulfate 7-Hydrate Fisher 60-019-68 CDM starter stock
Manganese Sulfate Fisher M113-500 Mix I stock
MilQ water Ultra-pure water
Mouse Fc Block BD Bioscience BDB553142 Clone: 2.4G2 DF 1:100
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT Fisher NC1886507 Eye lubricant for infection
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line  ATCC CRL-1848 H292 lung epithelial cell line for biofilm growth
Niacinamide Fisher 18-604-792 Vitamin stock
NK 1.1 AF 700 BD Bioscience 50-112-4692 Clone: PK136 DF 1:200
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk Fisher 50-200-5299 To remove oxygen from liquid cultures
Paraformaldehyde 4% in PBS Thermoscientific J19932-K2
Pivetal Isoflurane  Patterson Veterinary 07-893-8440 Isoflurane for anesthesia during infection 
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Chemical P288-500 Starter stock
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Chemical P285-500 Starter stock
Pyridoxal hydrochloride  Fisher AC352710250 Vitamin stock
Pyridoxamine dihydrochloride Fisher AAJ6267906 Mix I stock
Riboflavin Fisher AC132350250 Vitamin stock
Sodium Acetate VWR 0530-500G Starter stock
Sodium Azide  Fisher Bioreagents BP922I-500 For FACS buffer
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-500 Starter stock and final supplement to CDM
Sodium Phosphate Dibasic Fisher Chemical S374-500 Starter stock
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Chemical S369-500 Starter stock
TCR APC  BD Bioscience 50-112-8889 Clone: GL-3 DF 1:200
TCRβ APC-Cy7 BD Pharmigen BDB560656 Clone: H57-597 DF 1:200
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin Fisher R01227 Blood agar plates with the antibiotic gentamicin 
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated Fisher PI20233
Thiamine hydrochloride Fisher AC148991000 Vitamin stock
TIGR4 ATCC BAA-334 Streptococcus pneumoniae strain
Uracil Fisher AC157300250 Mix II stock
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g Fisher NC9693955

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References

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