Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En musmodell för övergången av Streptococcus pneumoniae från kolonisatör till patogen vid viral saminfektion rekapitulerar åldersförvärrad sjukdom

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64419
Automatic Translation
*1, *2,3, 2, 4, 2,5, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Microbiology, Tufts University School of Medicine, 3Graduate Program in Immunology, Tufts Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Translational Medicine, Lund University, 5Stuart B. Levy Center for the Integrated Management of Antimicrobial Resistance, Tufts University
* These authors contributed equally

Summary

Denna artikel beskriver en ny musmodell för övergången av pneumokocker från en asymptomatisk kolonisator till en sjukdomsframkallande patogen under virusinfektion. Denna modell kan lätt anpassas för att studera polymikrobiella och värd-patogeninteraktioner under de olika faserna av sjukdomsprogression och över olika värdar.

Abstract

Streptococcus pneumoniae (pneumokocker) är en asymptomatisk kolonisator av nasofarynx hos de flesta individer men kan utvecklas till en lung- och systemisk patogen vid influensa A-virus (IAV) infektion. Hög ålder ökar värdens mottaglighet för sekundär pneumokockpneumoni och är förknippad med försämrade sjukdomsutfall. Värdfaktorerna som driver dessa processer är inte väldefinierade, delvis på grund av brist på djurmodeller som reproducerar övergången från asymptomatisk kolonisering till svår klinisk sjukdom.

Denna artikel beskriver en ny musmodell som återskapar övergången av pneumokocker från asymtomatisk bärare till sjukdom vid virusinfektion. I denna modell inokuleras möss först intranasalt med biofilmodlade pneumokocker för att etablera asymtomatisk transport, följt av IAV-infektion i både nasofarynx och lungor. Detta resulterar i bakteriell spridning till lungorna, lunginflammation och uppenbara tecken på sjukdom som kan utvecklas till dödlighet. Graden av sjukdom är beroende av bakteriestammen och värdfaktorerna.

Det är viktigt att denna modell reproducerar mottagligheten av åldrande, för jämfört med unga möss visar gamla möss allvarligare klinisk sjukdom och ger efter för sjukdom oftare. Genom att separera vagn och sjukdom i distinkta steg och ge möjlighet att analysera de genetiska varianterna av både patogenen och värden, tillåter denna S. pneumoniae / IAV-saminfektionsmodell detaljerad undersökning av interaktionerna mellan en viktig patobiont och värden i olika faser av sjukdomsprogression. Denna modell kan också fungera som ett viktigt verktyg för att identifiera potentiella terapeutiska mål mot sekundär pneumokockpneumoni hos mottagliga värdar.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumokocker) är grampositiva bakterier som asymptomatiskt bor i nasofarynx hos de flesta friska individer 1,2. Främjas av faktorer som inte är helt definierade kan pneumokocker övergå från godartade kolonisatorer av nasofarynx till patogener som sprider sig till andra organ vilket resulterar i allvarliga infektioner, inklusive otitis media, lunginflammation och bakteriemi3. Pneumokocksjukdomspresentationen är delvis beroende av stamspecifika skillnader, inklusive serotypen, som är baserad på sammansättningen av kapselpolysackarider. Det har hittills karakteriserats över 100 serotyper, och vissa är förknippade med mer invasiva infektioner 4,5. Flera andra faktorer ökar risken för pneumokocksjukdom. En sådan faktor är virusinfektion, där risken för pneumokockpneumoni ökar 100-faldigt med IAV 6,7. Historiskt sett är S. pneumoniae en av de vanligaste orsakerna till sekundär bakteriell lunginflammation efter influensa och är förknippad med sämre resultat8. En annan stor riskfaktor är hög ålder. Faktum är att S. pneumoniae är den främsta orsaken till samhällsförvärvad bakteriell lunginflammation hos äldre individer över 65 år 9,10. Äldre individer står för majoriteten (>75%) av dödsfall på grund av lunginflammation och influensa, vilket indikerar att de två riskfaktorerna åldrande och IAV-infektion - synergistiskt förvärrar sjukdomskänsligheten11,12,13,14. De mekanismer genom vilka virusinfektion föranleder övergången av pneumokocker från asymptomatisk kolonisator till invasiv patogen och hur detta formas av värdfaktorer är dock fortfarande dåligt definierade. Detta beror till stor del på frånvaron av en liten djurmodell som rekapitulerar övergången från asymptomatisk pneumokockkolonisering till kritisk klinisk sjukdom.

Saminfektionsstudier har klassiskt modellerats på möss inokulerade med pneumokocker direkt i lungorna 7 dagar efter influensainfektion15,16. Detta reproducerar mottagligheten för sekundär bakteriell lunginflammation och är idealisk för att studera hur antivirala immunsvar försämrar antibakteriella försvar17. Longitudinella studier på människor har dock visat att pneumokocktransport i nasofarynx, där bakterierna kan bilda asymtomatiska biofilmer18, är enhetligt associerad med invasiva sjukdomar19,20. Bakteriella isolat från infektioner i mellanörat, lungan och blodet är genetiskt identiska med de som finns i nasofarynx20. För att studera övergången från asymtomatisk bärare till invasiv sjukdom efter IAV-infektion etablerades en modell där möss administrerades intranasalt biofilmodlade pneumokocker följt av IAV-infektion av nasofarynx21,22. Virusinfektion i de övre luftvägarna ledde till förändringar i värdmiljön som ledde till spridning av pneumokocker från biofilmer och deras spridning till de nedre luftvägarna21. Dessa dispergerade bakterier hade uppreglerat uttrycket av virulensfaktorer som är viktiga för infektion och omvandlat dem från kolonisatorer till patogener21. Dessa observationer belyser den komplexa interaktionen mellan viruset, värden och bakterierna och visar att förändringarna i värden som utlöses av virusinfektion har en direkt inverkan på pneumokockbeteendet, vilket i sin tur förändrar bakterieinfektionens gång. Denna modell misslyckas emellertid med att rekapitulera de allvarliga tecken på sjukdom som observerats hos människor, troligen för att viruset är begränsat till näshålan, och de systemiska effekterna av virusinfektion på värdimmunitet och lungskador rekapituleras inte.

Vi etablerade nyligen en modell som innehåller den komplexa interaktionen mellan värden och patogenerna men också närmare efterliknar sjukdomens svårighetsgrad som observerats hos människor23. I denna modell infekteras möss först intranasalt med biofilmodlade pneumokocker för att etablera asymtomatisk transport, följt av IAV-infektion i både nasofarynx och lungor. Detta resulterade i bakteriell spridning till lungorna, lunginflammation och sjukdom som utvecklades till dödlighet hos en bråkdel av unga möss23. Denna tidigare studie visade att både virus- och bakterieinfektion förändrade värdförsvaret: virusinfektion främjade bakteriell spridning och tidigare bakteriekolonisering försämrade värdens förmåga att kontrollera lung IAV-nivåer23. Undersökning av immunsvaret avslöjade att IAV-infektion minskade den antibakteriella aktiviteten hos neutrofiler, medan bakteriekolonisering avtrubbade typ I-interferonsvaret som är kritiskt för antiviralt försvar23. Det är viktigt att denna modell reproducerade mottagligheten av åldrande. Jämfört med unga möss visade gamla möss tecken på sjukdom tidigare, visade allvarligare klinisk sjukdom och gav efter för infektion oftare23. Arbetet som presenteras i detta manuskript visar att graden av sjukdom också är beroende av bakteriestammen, eftersom invasiva pneumokockstammar visar effektivare spridning vid IAV-infektion, visar mer uppenbara tecken på lunginflammation och resulterar i accelererade sjukdomsfrekvenser jämfört med icke-invasiva stammar. Således möjliggör denna S. pneumoniae / IAV-saminfektionsmodell detaljerad undersökning av både patogen- och värdfaktorer och är väl lämpad för att studera immunsvar mot polymikrobiella infektioner vid de olika faserna av sjukdomsprogression.

Protocol

Alla djurstudier utfördes i enlighet med rekommendationerna i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Alla förfaranden godkändes av University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Beredning av kemiskt definierade medier (CDM)

  1. Förbered lagren enligt följande:
    1. Lös blandningen I-föreningar som anges i tabell 1 i 100 ml ultrarent vatten under omrörning. Förvaras i 200 μl alikvoter vid −20 °C.
    2. Lös de blandning II-föreningar som anges i tabell 1 i 20 ml 0,1 M NaOH under omrörning. Förvaras i 100 μl alikvoter vid −20 °C.
    3. Lös blandningen III-föreningarna som anges i tabell 1 i 1 ml ultrarent vatten under omrörning. Förvaras i 10 μl alikvoter vid 4 °C.
    4. Lös blandningen IV-förening som anges i tabell 1 i 1 ml ultrarent vatten under omrörning. Förvaras i 10 μl alikvoter vid −20 °C.
    5. Lös upp föreningarna i tabell 2 initialt i 15 ml ultrarent vatten under omrörning. Justera pH till 7,0 med några droppar 0,1 M NaOH och justera den slutliga volymen till 20 ml med ultrarent vatten. Förvaras i 1 ml alikvoter vid −20 °C.
    6. Lös de föreningar som förtecknas i tabell 3 i 90 ml ultrarent vatten på en värmeplatta vid 50 °C under omrörning. Justera pH till 7,0 med 0,1 M NaOH och justera sedan den slutliga volymen till 100 ml med ultrarent vatten. Förvaras i 5 ml alikvoter vid -20 °C.
  2. Gör startfonden färsk varje gång genom att lösa föreningarna i tabell 4 i 70 ml ultrarent vatten under omrörning.
  3. Till det färska startlagret läggs följande blandningslager i ordning: 200 μl Mix I-lager (tabell 1), 80 μl Mix II-lager (tabell 1), 10 μl Mix III-lager (tabell 1), 10 μl Mix IV-lager (tabell 2), 1 ml vitaminlager (tabell 3) och 5 ml aminosyralager (tabell 4).
  4. När lagren har tillsatts, justera den slutliga volymen till 100 ml genom att tillsätta 30 ml ultrarent vatten till bägaren.
  5. Komplettera CDM med föreningar från tabell 4. Efter noggrann blandning, filtersteriliseras och förvaras vid 4 °C i högst 2 veckor.

2. Odling av biofilmen S. pneumoniae

  1. Bered RP-10-medium genom att blanda 445 ml RPMI 1640 med 50 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och 5 ml penicillin/streptomycin vid 10 000 E/ml respektive 10 000 μg/ml.
  2. Odla NCI-H292 (H292) mukoepidermoidkarcinomcellinje. Tillsätt cellerna från en inköpt injektionsflaska till 5 ml RP-10-medium i en T-25 vävnadsodlingsbehandlad kolv. Inkubera vid 37 °C/5 %CO2 i 3–5 dagar för att uppnå 100 % sammanflöde.
  3. Kontrollera cellerna under ett ljusmikroskop med 10x förstoring för att bedöma sammanflödet.
    OBS: När alla celler är i kontakt med andra celler och det inte finns några mellanrum däremellan, uppnås önskad 100% sammanflöde.
  4. Tvätta cellerna 2x i 5 ml rumstemperatur PBS. Se till att bufferten är kalciumfri för att undvika att kelatera EDTA i följande steg.
  5. Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA till kolven och inkubera vid 37 °C/5 %CO2 i 5–10 minuter tills cellerna lossnar. Neutralisera med 4 ml RP-10-medium. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner och överför till ett 50 ml koniskt rör.
  6. Tillsätt 500 μL av cellsuspensionen per brunn till en vävnadsodlingsbehandlad platta med 24 brunnar. Från en sammanflytande T-25-kolv, förvänta dig 2 × 10 6-4 × 106 celler / ml.
  7. Följande dag, kontrollera cellerna under ett ljusmikroskop för att se till att de är sammanflytande, som i steg 2.3. Om de inte är det, inkubera längre.
  8. När H292-cellerna är 100% sammanflytande i 24-brunnsplattan, tvätta cellerna försiktigt 3x med 1 ml rumstemperatur PBS för att säkerställa att inget medium som innehåller antibiotika eller skräp kvarstår.
  9. Efter tvättning av cellerna, tillsätt 250 μl / brunn med 4% paraformaldehyd för att fixera cellerna. Inkubera antingen 1 timme på is eller över natten vid 4 °C.
  10. Natten före cellfixering, stryk S. pneumoniae-stammen av intresse på blodagarplattor och inkubera över natten vid 37 ° C / 5% CO2.
    OBS: De data som presenteras här är med följande S. pneumoniae-stammar erhållna via kollaborativt utbyte: isolat av otitis media av serotyp 19F EF3030 24, klassisk serotyp 2 Avery-stam D3925 och isolat av serotyp 4-bakteriemi TIGR426. Stammarna är också tillgängliga från offentliga samlingar som hänvisas till i materialförteckningen.
  11. Bered CDM plus oxyras (0,15 E/ml) genom att tillsätta 100 μL oxyras (30 E/ml) till 20 ml CDM.
    OBS: Oxyras används för att eliminera syre för att möjliggöra effektiv tillväxt av S. pneumoniae i flytande kultur27.
  12. Inokulera bakterierna från plattan till färsk CDM + oxyras genom att tvätta bakterierna från plattan genom att tillsätta 1 ml CDM + oxyras och försiktigt lyfta bakteriekolonierna med sidan av en 1 ml pipettspets, var försiktig så att du inte skrapar agaren. Alternativt kan du använda en inokuleringsslinga för att lyfta bakterierna och inokulera dem i ett rör innehållande 1 ml CDM + oxyras.
  13. Späd bakterierna i CDM + oxyras till en start-OD600 på 0,05.
  14. Odla bakterierna i ett löst kapslat 50 ml koniskt rör som står vid 37 ° C / 5% CO 2 tills en OD600 på 0,2 uppnås (detta tar var som helst mellan2-5 timmar). Kontrollera OD600 varje timme för att säkerställa att OD inte överstiger 0,2.
  15. När OD har nått 0,2, virvla bakterieodlingsröret. Frö 0,5 ml av bakterierna på de fasta H292-cellerna och tillsätt ytterligare 0,5 ml CDM + oxyrasmedium per brunn. Tillsätt 1 ml CDM + oxyras till kontrollbrunnarna utan bakterier. Inkubera plattan i 48 timmar vid 34 °C/5 %CO2.
    OBS: Tillväxt vid 34 ° C används för att närmare efterlikna den lägre temperaturen i nasofarynx21.
  16. Var 12: e timme efter den första sådden, ta försiktigt bort 0,5 ml av mediet och fyll på med 0,5 ml färsk CDM + oxyras. Var försiktig så att du inte stör den bildande biofilmen. Kontrollera botten av plattan för biofilm och leta efter ökad grumlighet när tiden går på grund av biofilmens tillväxt. För att kontrollera kontaminering, kontrollera brunnarna utan bakterier för att säkerställa att kontrollbrunnarna förblir fria.
  17. Vid 48 timmar efter inokulering, ta bort supernatanten och tvätta 2x mycket försiktigt med 1 ml PBS. Återsuspendera i 1 ml färsk CDM och pipettera kraftigt upp och ner för att lyfta biofilmen. För varje bakteriestam, slå samman bakterierna från alla brunnar i ett 50 ml koniskt rör. Blanda väl genom att försiktigt luta det tätt täckta röret upp och ner flera gånger.
  18. Till 50 ml koniskt rör, tillsätt 40% glycerol i CDM vid lika stora volymer för att uppnå en bakteriell suspension med en slutlig koncentration av 20% glycerol. Alikvot 1 ml i mikrocentrifugrör, frys blixtfrys på torris och spara vid −80 °C.
  19. Före användning, räkna upp bakterierna genom att tina en alikvot på is, snurra röret vid 1 700 × g i 5 minuter, avlägsna supernatanten, återsuspendera pelleten i 1 ml PBS och plätera seriella utspädningar på blodagarplattor28.
  20. Odla agarplattorna över natten vid 37 °C/5 % CO2 och räkna kolonierna vid relevanta utspädningar för att erhålla bakteriekoncentrationen i kolonibildande enheter (CFU)/ml.
    OBS: Det rekommenderas att räkna upp bakterierna i bestånden minst en dag efter frysning eller senare, eftersom det finns en minskning av bakteriell livskraft inom de första 24 timmarna. De lagrade frysta alikvoterna kan användas för efterföljande infektion av möss i högst 2 månader.

3. Intranasal inokulering av möss med biofilmodlad S. pneumoniae

  1. Köp möss och använd vid önskad ålder.
    OBS: Möss i åldern 3-4 månader föredras framför modell unga värdar, och möss i åldern 21-24 månader kan användas för att modellera äldre individer >65 år29 år. De data som presenteras här är med C57BL/6 hanmöss.
  2. Tina de biofilmodlade bakteriealikvoterna på is och snurra vid 1 700 × g i 5 minuter. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten utan att störa pelleten, tvätta bakterierna genom att återsuspendera pelleten i 1 ml PBS och snurra igen vid 1 700 × g i 5 minuter. Ta bort supernatanten och suspendera pelleten igen i den volym som behövs för att nå önskad koncentration (sikta på 5 × 106 CFU/10 μL för intranasal inokulering). Bekräfta mängden bakterier som administreras genom plätering av det beredda inokulatet på blodagarplattor enligt steg 2.19.
  3. Inokulera mössen intranasalt med 5 × 106 CFU genom att pipettera 5 μL av den utspädda ympkulturen i varje naris. Se till att hålla mössen ordentligt och stabilisera huvudet tills volymen inhaleras (vanligtvis inom några sekunder efter pipettering av volymen i näsorna). Utför detta steg i frånvaro av anestesi för att förhindra pulmonell aspiration av inokulum.

4. Virusinfektion med influensa A-virus (IAV)

  1. Vid 48 timmar efter intranasal inokulering med S. pneumoniae, tina IAV-stammen av intresse på is.
    OBS: De data som presenteras här är med en musanpassad stam av influensa A-virus A/PR/8/34 H1N1 som erhölls via kollaborativt utbyte30.
  2. När viruset har tinat, späd viruset i PBS till önskad koncentration; sikta på 20 plackbildande enheter (PFU)/50 μL för intratrakeal infektion och 200 PFU/10 μL för intranasal infektion. För mock-infekterade och bakterie-bara grupper, använd PBS för att inokulera mössen.
  3. Placera oftalmiskt smörjmedel på mössens ögon före anestesi. Bedöva mössen med 5% isofluran och bekräfta anestesi med en fast tånypa.
  4. När djuret är bedövat, ta ut det från isoflurankammaren och infektera omedelbart de bedövade mössen med 50 μL (20 PFU) IAV intratrakealt med hjälp av trubbig pincett för att dra tungan ur munnen och pipettera vätskevolymen ner i luftstrupen.
  5. Placera mössen i en separat bur och övervaka tills fullständig återhämtning (de kan upprätthålla sternal liggande [kunna ligga upprätt på bröstet]).
  6. Efter återvinning inokulerar mössen omedelbart intranasalt med 10 μl (200 PFU) IAV med inokuleringsmetoden i steg 3.3.
  7. Husmöss som har genomgått enkel eller dubbel bakteriell och virusinfektion med samma infektionsgrupp och separerar dem från de andra grupperna.

5. Övervakning av mössen för sjukdomssymtom

  1. Övervaka mössen dagligen i minst 10 dagar och blint poäng för tecken på sjukdom enligt följande:
    1. Poäng enligt följande för viktminskning: 0 = 5% eller mindre; 1 = 5% -10%; 2 = 10% -15%; 3 = 20% eller mer. Avliva mössen med hjälp av CO2-inandning när viktminskningspoängen är 3.
    2. Poäng enligt följande för aktivitet: 0 = normal / aktiv; 1 = rörlig men något minskad; 2 = minskat; 3 = kraftigt förminskad/slö (rör sig endast vid beröring), 4 = koma/orörlig. Avliva mössen när aktivitetspoängen är 3.
    3. Poäng enligt följande för hållning: 0 = ingen aning (normal); 1 = lätt böjd hållning; 2 = svår föraning. Avliva mössen när hållningspoängen är 2.
    4. Poäng enligt följande för ögonen: 0 = normal; 1 = utskjutande; 1 = sjunken; 1 = stängd; 1 = urladdning. Det kan vara en kombination. Lägg till summorna för den slutliga ögonpoängen.
    5. Poäng enligt följande för andning: 0 = Normal andning; 1 = oregelbunden eller oförändrad (högre/lägre frekvens); 2 = ansträngd (överdriven ansträngning eller flämtning). Avliva mössen när andningspoängen är 2.
  2. Baserat på ovanstående kriterier, lägg till de individuella poängen för en total klinisk poäng av frisk (0) till extremt sjuk (15). Tänk på att alla möss som visar en total poäng över 2 är sjuka. Avliva alla möss som visar en total poäng över 9 eller de angivna poängen för varje kriterium och markera dem på överlevnadskurvan.

6. Bearbetning av infekterade vävnader för bakterieräkning

  1. Vid 48 timmar efter IAV-infektion, avliva mössen.
  2. Placera musen i ryggläge. Använd 70% etanol, spraya musens bröst och buk för att rengöra pälsen. Nyp pälsen och huden i mitten av musen med pincett och klipp pälsen med 4,5 i dissektionssax för att exponera området från levern upp till bröstet.
  3. Insamling av blod
    1. Använd dissektionssax och skär försiktigt in i bukhålan för att exponera levern. Använd pincett, exponera leverportalvenen på toppen av levern nära membranet. Skär leverportalvenen med dissektionssaxen. När blodet börjar samlas i bukhålan, samla 10 μL blod med hjälp av en mikropipett och placera i 90 μL antikoagulerande lösning (50 mM EDTA-lösning i PBS) i ett mikrocentrifugrör för plätering för bakteriebelastning.
    2. Använd en P-1000 mikropipett för att samla resten av blodet, placera det i ett bloduppsamlingsrör och centrifugera vid 7 600 × g i 2 minuter för att samla serumet. Spara serumen i mikrocentrifugrör vid −80 °C för efterföljande analys av önskat cytokin eller metabolit.
  4. Lung insamling
    1. Använd dissektionssax, skär upp sidorna på den exponerade bröstkorgen och dra försiktigt revbenen upp mot musens huvud för att exponera hjärtat. För in en 25 G nål fäst vid en 10 ml spruta förfylld med PBS i höger kammare och börja långsamt perfusera. Leta efter blekning av lungorna som en indikator på framgångsrik perfusion. Spola långsamt för att undvika att bryta lungvävnaden.
    2. Lyft hjärtat med pincetten och gör ett snitt för att separera lungorna och hjärtat. När du har separerat, plocka upp alla lunglober med pincetten och skölj i en skål med steril PBS för att avlägsna eventuellt kvarvarande blod. I en petriskål, hacka lungorna i små bitar och blanda väl. Ta bort hälften av lungblandningen för bestämning av bakteriell CFU eller viral PFU och placera den i ett runt botten 15 ml rör förfyllt med 0,5 ml PBS för homogenisering.
      OBS: Det är viktigt att inte ta olika lober av samma lunga för de olika bedömningarna. Istället bör alla lober hackas, blandas väl ihop och analyseras lika för de olika bedömningarna.
    3. Ta bort den andra halvan av lungan för flödescytometri (avsnitt 7 nedan) och placera den i en icke-vävnadskulturbehandlad 24-brunnsplatta med varje brunn förfylld med 0,5 ml RP-10. Låt stå i rumstemperatur tills bearbetning.
  5. Nasofarynx kollektion
    1. Vid nacken, använd dissektionssaxen för att klippa bort pälsen och klipp sedan bort muskeln och exponera luftstrupen.
      OBS: Trachea är en rörliknande struktur som ligger under muskeln.
    2. Placera små pincett under luftstrupen på ett avstånd av 1 cm från musens käke för att stabilisera den. Använd dissektionssax, gör försiktigt en 0,1 cm slits på den främre delen av luftstrupen och undvik att skära luftstrupen helt.
    3. Förbered en 1 ml spruta fylld med 0,5 ml PBS med 0,58 mm slang fäst vid en 25 G nål. Samla nässköljningen genom att sätta in slangen i luftstrupen som går uppåt mot nasofarynxen. När motstånd känns in i näshålan, placera ett mikrocentrifugrör vid näsan och spola långsamt PBS genom luftstrupen för att samla nässköljningen.
    4. Placera musen i ett benäget läge. Spraya musens huvud med etanol. Använd dissektionssax för att klippa pälsen och mystacial pad för att exponera musens huvudben.
    5. Använd dissektionssaxen och gör en 1 cm skärning längs underkäkens sidor och mellan ögonen. Använd pincett och dra långsamt ansiktsbenen bort från kroppen för att exponera näshålan.
    6. Använd pincett för att försiktigt ta bort näsvävnaden och placera den i ett runt bottenrör förfyllt med 0,5 ml PBS för homogenisering.
  6. För att homogenisera den uppsamlade vävnaden, rengör först homogenisatorsonden genom att lägga den i 70% etanol och slå på homogenisatorn med 60% effekt i 30 sekunder. Upprepa steget i sterilt vatten i 10 s. Homogenisera varje vävnad i 1 min. Rengör homogenisatorsonden i sterilt vatten mellan varje prov och i ett nytt rör med 70% etanol mellan varje organ och provgrupp.
  7. Uppräkning av bakterienummer
    1. När alla organ har skördats och homogeniserats, plåt serieutspädningar på blodagarplattor. För att beräkna den totala CFU, använd 10 μL för att platta och notera den slutliga volymen i ml för varje prov. Platta nasofarynxproverna på blodagarplattor kompletterade med 3 μg/ml gentamicin för att välja för tillväxt av S. pneumoniae samtidigt som tillväxten av andra mikroorganismer som koloniserar den vävnaden hämmas. Inkubera över natten vid 37 °C/5 %CO2.
    2. För att räkna upp bakteriell CFU för lungan och nasofarynx, räkna först kolonierna på blodagarplattorna. Använd sedan ekvation (1) och ekvation (2) för att beräkna mängden per ml och totalt antal.
      Mängd per ml = antal mikroorganismer × utspädningsfaktor × 100 (1)
      Totalt antal = mängd per ml × total volym per prov (2)
      OBS: I ekvation (1) används 100 för att multiplicera eftersom 10 μL pläteras, vilket är en 100-faldig utspädning av 1 ml. Den totala volymen per prov i ekvation (2) är från steg 6.7.1, vilket resulterar i detektionsgränsen på 100 per organ.
    3. För att räkna upp bakteriell CFU För bakteriemi, räkna först kolonierna på blodagarplattorna. Använd sedan ekvation (3) för att bestämma mängden per ml blod.
      Mängd per ml blod = antal kolonier × utspädningsfaktor × 100 × 10 (3)
      OBS: I ekvation (3) används 100 som 10 μL pläteras, vilket är en 100-faldig utspädning av 1 ml, och 10 indikerar en 1:10 utspädning av blodet i antikoagulant. Detta resulterar i detektionsgränsen på 1 000/ml.

7. Bearbetning av lungproverna för flödescytometri

  1. Förbered önskat medium enligt följande:
    1. Förbered RP-10 enligt beskrivningen i steg 2.1.
    2. Bered digestionsbufferten genom att blanda RP-10 med 2 mg/ml kollagenas och 30 μl/ml DNas I.
    3. Förbered lysbuffert genom att lösa upp 8,29 gNH4Cl, 1 gNaHCO3 och 0,038 g EDTA i 1 literH2O.
    4. Förbered 10x FACS-buffert genom att blanda 450 ml HBSS med 50 ml värmeinaktiverad FBS och 5 g natriumazid.
    5. Förbered 1x FACS-buffert genom att späda 50 ml 10x FACS-buffert i 450 ml HBSS.
  2. Ta lungproverna från steg 6.4.3 och placera dem i en platta med 24 brunnar. Tillsätt 500 μL rötningsbuffert till varje brunn. Inkubera i 45 minuter upp till 1 timme vid 37 °C/5 %CO2.
  3. Förfyll 50 ml koniska rör för varje prov med 5 ml RP-10. När inkubationen är över, placera ett 100 μm filter på toppen av det 50 ml koniska röret och blöt det med 1 ml RP-10.
  4. Använd en P-1000 mikropipett, flytta de smälta lungorna och placera dem på filtret. Använd kolven på en 3 ml spruta för att mosa orgeln. Skölj 2x med 1 ml RP-10 varje gång.
  5. Snurra proverna vid 4 °C och 327 × g i 5 minuter. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 1 ml lysbuffert. Låt verka i 3 minuter för att tillåta lys av de röda blodkropparna. Neutralisera med 5 ml RP-10.
  6. Snurra proverna vid 4 °C och 327 × g i 5 minuter. Aspirera supernatanten, suspendera pelleten igen i 1 ml RP-10 och ta 10 μL för att räkna proverna.
  7. Snurra proverna vid 4 °C och 327 × g i 5 minuter. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i RP-10 vid 2 × 10 6-4 × 106 celler/ml. Tillsätt 60 μl av varje prov i en platta med 96 brunnar för att färga för de önskade celltyperna23 som anges i steg 7.9, tabell 5 och tabell 6.
  8. Snurra plattan vid 4 °C och 327 × g i 5 minuter.
  9. Förbered under tiden antikroppsmasterblandningarna, florescerande minus en (FMO) och enkelfläckkontroller med önskade antikroppar. För att färga för polymorfonukleära leukocyter (PMN), makrofager, monocyter, dendritiska celler och T-celler, använd antikropparna och slutliga utspädningar som anges i tabell 5 och tabell 6. Använd en total volym på 100 μl/brunn av antikroppsblandningen. Följ de spädningar som anges i tabellerna för bestämning av lämplig volym mastermix och de enskilda antikroppar som krävs.
  10. När centrifugeringen är klar (steg 7.8), dekantera supernatanten, återsuspendera pelletsen i 100 μL av antikroppsblandningarna, FMO: erna eller enkelfläckkontrollerna och inkubera på is i 30 minuter i mörkret.
  11. Tvätta cellerna 2x genom att tillsätta 150 μL FACS-buffert till brunnarna och snurra plattan vid 4 °C och 327 × g i 5 minuter.
  12. När centrifugeringen är klar, dekantera supernatanten, återsuspendera pelletsen i 100 μL fixeringsbuffert och inkubera på is i 20 minuter.
  13. Tvätta cellerna 2x genom att tillsätta 150 μL FACS-buffert till brunnarna och snurra plattan vid 4 °C och 327 × g i 5 minuter.
  14. Förbered märkta FACS-rör med 200 μL FACS-buffert. Återsuspendera pelletsen i 150 μl FACS-buffert. Filtrera varje prov individuellt i motsvarande FACS-rör med ett 100 μm-filter. Förvaras på is eller vid 4 °C och skyddas från ljuset tills det är klart att analyseras.
  15. Analysera cellerna med hjälp av en flödescytometer.

8. Plackanalys för uppräkning av IAV

  1. Förbered önskat medium enligt följande:
    1. Bered infektionsmediet genom att lösa upp 2,5 g bovint serumalbumin (BSA) i 40 ml DMEM under omrörning vid 37 °C i 10-20 minuter tills det är upplöst. Filtersterilisera till 460 ml DMEM.
    2. Bered 2,4% mikrokristallin cellulosa genom att lösa 1,2 mg mikrokristallin cellulosa i 50 mlH2O. Autoklav på vätskeinställningen och förvara vid rumstemperatur.
    3. Bered 5 % av BSA DMEM genom att lösa upp 2,5 g BSA i 40 ml DMEM under omrörning vid 37 °C i 10–20 minuter. Tillsätt de återstående 10 ml DMEM för en slutlig volym på 50 ml. Filtersterilisera och förvara vid 4 °C.
    4. Förbered 2x MEM / 0,5% BSA genom att blanda 1 ml 5% BSA DMEM med 9 ml 2x MEM.
    5. Förbered överlagringsmedium med låg viskositet genom att blanda ett 1: 1-förhållande av 2,4% mikrokristallin cellulosa och 2x MEM / 0,5% BSA med 1 mg / ml TPCK (hämmare av chymotrypsin) trypsin.
    6. Förbered EMEM / 10% FBS genom att blanda 450 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) med 50 ml värmeinaktiverad FBS.
  2. Odla Madin-Darby hundnjure (MDCK) cellinje. Tillsätt cellerna från en köpt injektionsflaska till 5 ml EMEM/10% FBS i en T-25 vävnadsodlingsbehandlad kolv. Inkubera i 3-5 dagar vid 37 °C/5%CO2 tills cellerna når 100% sammanflöde. Kontrollera om det finns flyt som i steg 2.3.
  3. Ta bort och kassera odlingsmediet och skölj 2x med 5 ml rumstemperatur PBS. Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA till kolven och inkubera vid 37 °C/5 %CO2 i 10–15 minuter tills cellerna lossnar. När den har lyfts, neutralisera med 4 ml EMEM / 10% FBS för att erhålla en cellsuspension vid 2 × 105 celler / ml.
  4. Frö MDCK-cellerna i en 12-brunns vävnadsodlingsbehandlad platta genom att tillsätta 1 ml resuspenderade celler per brunn (vid 2 × 105 celler / brunn) 1 dag innan plackanalysen påbörjas.
    OBS: Se till att cellerna når 100% sammanflöde före användning och inkubera längre om det behövs för att nå sammanflöde.
  5. För användning som standard, gör 10-faldiga seriella utspädningar (106-10 1) av IAV-lager (med en känd titer) i infektionsmediet som anges i steg 8.1.1. Gör 1,2 ml av varje spädning för att testa i tre exemplar.
  6. Tina organhomogenaten på is. Snurra ner på en bordscentrifug vid 2 000 × g och samla upp den klara supernatanten.
  7. Upprepa steg 8.5 men med supernatanten från proverna i steg 8.6.
  8. Aspirera mediet från cellerna och tvätta 2x med 1 ml PBS för att ta bort alla FBS.
  9. Tillsätt försiktigt 300 μl av varje standardutspädning eller serieutspätt prov längs sidan av varje brunn, med början vid den högsta utspädningen till den lägsta, och gör detta i tre exemplar.
  10. Placera plattorna i inkubatorn vid 37 °C/5% CO2, skaka plattan var 10:e minut i totalt 50 minuter. Se till att placera dem platt i inkubatorn och stapla dem inte.
  11. Efter 50 minuter, tvätta cellerna 2x med 1 ml PBS.
  12. Tillsätt 2 ml av lågviskositetsöverlagringsmediet i varje brunn utom brunnarna med lägsta utspädning och virusfri användning. Till dessa, lägg till infektionsmedium och trypsin.
  13. Sätt tillbaka plattan i inkubatorn vid 37 °C/5%CO2 i 2-4 dagar för att få plack som kan visualiseras med blotta ögat.
  14. Tvätta plattorna genom att tillsätta 2 ml PBS i varje brunn snabbt från sidan och skaka försiktigt för att suspendera det sedimenterade lågviskösa överlagringsmediet.
  15. Kassera hela vätskevolymen i brunnen genom att försiktigt pipettera bort mediet.
  16. Upprepa tvätten en gång till med 2 ml PBS i varje brunn och kassera sedan hela vätskevolymen genom försiktig pipettering.
  17. För att fixera placken, tillsätt 500 μL 4% paraformaldehyd i varje brunn, skaka och låt sitta i 30 minuter.
  18. Tvätta långsamt ner på sidan med 1 ml PBS; Kassera sedan försiktigt vätskan.
  19. Tillsätt 500 μL 1% kristallviolett (utspädd i vatten) till varje brunn för att täcka cellmonoskiktet. Inkubera i 5 min.
  20. Tvätta med 1 ml kranvatten. Se till att kasta all vätska i brunnen genom försiktig pipettering. Placera plattan upp och ner på en blöjkudde för att torka över natten.
  21. Räkna placken visuellt och spara bilderna på alla tillgängliga bilder.

Representative Results

Biofilmodlad S. pneumoniae (figur 1A) användes för att infektera möss (figur 1B) med hjälp av en liten 10 μL inokulum levererad intranasalt till osövda möss. Denna lilla volym inokulum resulterar i konsekvent pneumokocktransport begränsad till nasofarynx (figur 2A, + sp-grupperna) samtidigt som systemisk spridning undviks (figur 2B, C, + sp-grupper). Två dagar efter intranasal inokulering infekterades mössen med ett murinanpassat H1N1-influensa A-virus A/PR/8/34 (IAV)22,30 levererat både intranasalt och intratrakealt för att uppnå konsekvent tillförsel av specifika mängder till nasofarynx och lungorna 23.

Här användes modellen för att jämföra sjukdomsförloppet efter virusinfektion hos möss intranasalt utmanade med olika stammar av S. pneumoniae, inklusive TIGR4 och D39, som är invasiva stammar som resulterar i lunginflammation som utvecklas till bakteriemi, och EF3030, som är en otitis media-stam 21,24,25,26,31. Sjukdomspresentationen hos S. pneumoniae/IAV-infekterade möss var beroende av bakteriestammen (figur 2). Även om det inte fanns någon signifikant skillnad i bakterieantal i nasofarynx (figur 2A) bland någon av stammarna, spreds S. pneumoniae TIGR4 och D39, men inte EF3030, till lungorna vid 48 timmar efter IAV-infektion (figur 2B). Fyrtio procent av mössen intranasalt infekterade med S. pneumoniae TIGR4 visade bakteriell spridning till lungorna, och av dem blev hälften av dem bakteriemiska (figur 2C), i överensstämmelse med tidigare fynd23.

Möss intranasalt infekterade med S. pneumoniae D39 visade effektivare spridning, eftersom spridning till lungorna observerades hos 100% av de saminfekterade mössen (figur 2B). I likhet med S. pneumoniae TIGR4 upplevde hälften av dem bakteriemi (figur 2C). Vid spårning av den totala överlevnaden, oavsett bakteriestammen, var överlevnadsgraden för saminfekterade möss signifikant lägre än mössen som ensam utmanades med S. pneumoniae ensam för alla testade stammar (figur 2D). Jämfört med kontrollmössen som utmanades med enbart IAV uppvisade mössen intranasalt infekterade med S. pneumoniae TIGR4 och D39, men inte EF3030, accelererade sjukdomsfrekvenser. Vid dag 2 efter IAV-infektion hade 30% (D39) och 20% (TIGR4) av mössen dukat under, medan IAV-kontrollgrupperna inte började ge efter förrän dag 5 efter utmaning (figur 2D). Mössen som var saminfekterade med S. pneumoniae EF3030 och IAV hade fördröjda symtom, mer lik IAV-kontrollerna (figur 2D). Dessa fynd visar att saminfektionsmodellen resulterar i sjukdom hos unga friska möss som är bakteriestamberoende, vilket gör den idealisk för att utforska de bakteriella faktorer som krävs vid varje steg av sjukdomsprogression.

Denna modell användes för att bedöma förekomsten av olika immunceller i lungorna (celltyper och grindstrategi i figur 3) efter IAV-infektion hos möss intranasalt inokulerade med olika stammar av S. pneumoniae. Bakteriestammarna D39 och TIGR4, som spreds i lungorna efter IAV-infektion, framkallade en signifikant ökning över baslinjen (oinfekterad) i inflödet av inflammatoriska immunceller från cirkulationen, såsom neutrofiler (PMN) och monocyter, medan EF3030 inte gjorde det (figur 4A-C). Enbart IAV-infektion framkallade en signifikant ökning över baslinjen i tillströmningen av immunceller som är viktiga för värdförsvar mot virusinfektion, såsom NK-celler och gamma-delta T-celler (figur 4A-C). Dessa antivirala svar trubbades signifikant av hos möss intranasalt infekterade med S. pneumoniae före viral utmaning (figur 4A-C). Detta överensstämmer med tidigare studier som utvärderade cytokinsvar som fann att S. pneumoniae-vagnen trubbade av produktionen av typ I-interferoner och försämrade värdens förmåga att kontrollera IAV-belastningar i lungorna23. Dessa fynd visar att co-infektionsmodellen kan användas för att studera hur immunsvar förändras vid mono- kontra polymikrobiella infektioner.

Denna modell användes också för att bedöma effekten av åldrande på sjukdomsförloppet efter IAV-infektion hos möss intranasalt infekterade med S. pneumoniae TIGR4. Hos enstaka infekterade möss varierade inte virustitrarna mellan de unga och åldrade kohorterna (figur 5A)23. Liksom i tidigare studier23 uppvisade gamla möss tidigare och signifikant allvarligare tecken på sjukdom jämfört med sina unga motsvarigheter, vilket framgår av de högre kliniska poängen (figur 5B). I överensstämmelse med sjukdomssymtomen började gamla möss inokulerade med S. pneumoniae dö snabbare inom 24 timmar efter IAV-infektion, och alla gav efter för sjukdomen, medan de unga kontrollerna överlevde infektionen med en signifikant högre (33%) hastighet (figur 5C). Dessa fynd visar att saminfektionsmodellen kan användas för att upptäcka allvarligare sjukdom hos sårbara värdar, vilket gör den idealisk för att utforska värdfaktorer som ger resistens eller mottaglighet för saminfektion.

Figure 1
Figur 1: Tidslinje för samtidig infektion och organbearbetning för bedömning av immuncellsinflöde och patogenbörda . (A) Streptococcus pneumoniae odlas i biofilmer. (B) Möss inokuleras intranasalt med 5 × 106 CFU av den angivna biofilmodlade S. pneumoniae-stammen för att etablera nasofaryngeal transport eller lämnas obehandlad. Fyrtioåtta timmar senare behandlas mössen antingen med PBS eller får 200 PFU influensa A-virus PR8 intranasalt och 20 PFU intratrakealt. Möss övervakas över tid för kliniska sjukdomspoäng och överlevnad. (C) Vid 48 timmar efter IAV-infektion bedöms bakteriell CFU eller viral PFU i de olika organen eller immuncellsinflöde i lungorna. Förkortningar: CFU = kolonibildande enheter; PFU = plackbildande enheter; IAV = influensa A-virus PR8; IT = intratrakealt; NP = nasofaryngealt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Dubbel intranasal/intratrakeal IAV-infektion hos S. pneumoniae-inokulerade möss leder till bakteriell spridning och sjukdom som är beroende av bakteriestammen. Unga (10-12 veckor gamla) manliga C57BL/6 (B6) möss infekterades enligt figur 1. Bakterieantalet i (A) nasofarynx, (B) lungor och (C) blod bestämdes alla vid 48 timmar efter IAV-infektion. (B,C) Procentandelar anger andelen möss som uppvisade spridning. (D) Överlevnaden övervakades i 10 dagar efter IAV-infektion. Poolade data från (A,B) n = 5, (C) n = 11 och (D) n = 6 möss per grupp visas. Varje cirkel motsvarar en mus, och de streckade linjerna anger detekteringsgränsen. (A-C) *, indikerar en signifikant skillnad (p < 0,05) mellan de angivna grupperna enligt Kruskal-Wallis-testet. (D) *, indikerar en signifikant skillnad (p < 0,05) mellan +sp- och Co-inf-möss per bakteriestam enligt log-rank-testet (Mantel-Cox). Förkortningar: +sp = möss infekterade intranasalt med bakterier endast med den angivna stammen; Co-inf = bakterieinfekterade möss som infekterades med IAV; IAV = möss som fick influensa A-virus; CFU = kolonibildande enheter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Immuncellsgrindstrategi. Lungorna skördades och immuncellsinflödet bestämdes genom flödescytometri. Den representativa grindstrategin för de olika celltyperna visas. (A) CD45+, levande enskilda celler inhägnades och procentandelarna av (B) PMN (Ly6G+, CD11b+), makrofager (Ly6G-, Ly6C-, F480+) och monocyter (Ly6G-, Ly6C+), (C) DCs (Ly6G-, CD11c+) och NK-celler (NK1.1+, CD3-), (D) TCR-γΔ och CD8 (CD8+, TCRβ+) och CD4 (CD4+, TCRβ+ ) T-celler bestämdes. Förkortningar: SSC-A = sidospridningstoppare; FSC-A = spridningstoppområde framåt, FSC-H = spridning-topphöjd framåt, SSC-W = sidospridningstoppbredd; L/D = levande/döda; FMO = fluorescerande minus en; NK = naturlig mördare; PMN = polymorfonukleär leukocyt; DC = dendritisk cell; TCR = T-cellreceptor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Pulmonella immunsvar är bakteriell stamberoende. Unga (10-12 veckor gamla) C57BL/6 hanmöss var antingen oinfekterade, individuellt inokulerade med den indikerade Streptococcus pneumoniae-stammen (+ sp), var för sig utmanade med IAV (IAV) eller saminfekterade med S. pneumoniae och IAV (Co-inf). Fyrtioåtta timmar efter IAV-infektion (se den experimentella designen i figur 1) skördades lungorna och immuncellsinflödet bestämdes genom flödescytometri enligt grindstrategin i figur 3. (A) De genomsnittliga procentandelarna för varje indikerad celltyp inom CD45-grinden visas för alla behandlingsgrupper på värmekartan. (B) Representativa punktdiagram över celltyper som uppvisade signifikanta skillnader mellan behandlingarna visas för varje musgrupp. (C) Procentandelarna för de angivna immuncellstyperna visas. Varje cirkel motsvarar en mus. (A, C) Poolade data från n = 5 möss per grupp visas. *, indikerar en signifikant skillnad (p < 0,05) mellan Co-inf och oinfekterad; $, indikerar en signifikant mellan IAV och oinfekterad; #, indikerar en signifikant skillnad mellan enbart Co-inf och IAV. Signifikanta skillnader mellan utmaningsgrupperna för varje celltyp bestämdes av ANOVA följt av Tukeys test. Förkortningar: NK = naturlig mördare; PMN = polymorfonukleär leukocyt; DC = dendritisk cell; TCR = T-cellreceptor; IAV = influensa A-virus. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Åldrande och ökad värdkänslighet för IAV / Streptococcus pneumoniae saminfektion. Unga (10-12 veckor) och äldre (21-22 månader) C57BL/6 hanmöss var saminfekterade med S. pneumoniae TIGR4 i.n. och IAV i.n. och i.t. (som i figur 1) eller var för sig utmanade med enbart IAV. (A) Virala titrar bestämdes 48 timmar senare. Asterisker indikerar statistisk signifikans (p < 0,05) som bestäms av studentens t-test. Data slås samman från n = 4 möss per grupp. (B) Klinisk poäng och (C) överlevnad övervakades över tid. (B) Medelvärdet ± SEM poolat från n = 6 möss per grupp visas. Asterisker indikerar statistisk signifikans (p < 0,05) mellan unga och gamla möss vid den angivna tidpunkten som bestäms av Mann-Whitney-testet. (C) Data slås samman från n = 6 möss per grupp. Asterisker indikerar statistisk signifikans (p < 0,05) mellan unga och gamla möss som bestäms av log-rank (Mantel-Cox) test. Förkortningar: IAV = influensa A-virus; i.n. = intranasalt; i.t. = intratrakealt; SEM = medelmedelts standardfel. Figur 5A återges med tillstånd från Joma et al.23. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Mix I-lager för CDM
Adenin 0,1 gr
D-alanin 0,25 gr
CaCl2 Vattenfri 0.025 gr
Mangansulfat 0.03 gr
Cyanocobalamin 100 μl 10 mg/ml lager
Para-aminobensoesyra 400 μl 5 mg/ml stam
Pyridoxamin 2HCl 100 μl 10 mg/ml lager
Mix II-lager för CDM
Guanin 0.05 gr
Uracil 0.05 gr
Mix III-lager för CDM
Järnnitrat9H2O 50 mg/ml
Järnsulfat7H2O 10 mg/ml
Mix IV-lager för CDM
Beta-nikotinamidadenindinukleotid 25 mg/ml

Tabell 1: Blandade lager av I, II, III och IV för CDM. Förkortning: CDM = kemiskt definierade medier.

Vitamin Mix Stock för CDM
Pyridoxalhydroklorid 0,8 gr
Tiamin Cl2 0,4 gr
Riboflavin 0,4 gr
Ca-pantotenatat 0,4 gr
Biotin 0.04 gr
Folsyra 0,4 gr
Niacinamide 0,4 gr

Tabell 2: Buljong av vitaminblandning för CDM. Förkortning: CDM = kemiskt definierade medier.

Aminosyralager för CDM
L-alanin 0.480 gr
L-arginin 0.250 g
L-asparagin 0.700 g
L-asparaginsyra 0.600 gr
L-cystein 1.000 g
L-cystin 0.100 g
L-glutaminsyra 0.200 g
L-glutamin 0.780 gr
L-glycin 0.350 g
L-histidin 0.300 gr
L-isoleucin 0.430 gr
L-leucin 0.950 gr
L-lysin 0.880 gr
L-metionin 0.250 g
L-fenylalanin 0.550 gr
L-Proline 1.350 gr
L-Serine 0.680 gr
L-treonin 0.450 gr
L-tryptofan 0.100 g
L-Valin 0.650 gr

Tabell 3: Aminosyrastam för CDM. Förkortning: CDM = kemiskt definierade medier.

Startlager för CDM
Druvsocker 1.0 gr
Magnesiumsulfat-7-hydrat 0.070 gr
Kaliumfosfat Dibasiskt 0.02 gr
Kaliumfosfat monobasiskt 0,1 gr
Natriumacetat vattenfritt 0.45 gr
Bikarbonat 0,25 gr
Natriumfosfat Dibasiskt 0.735 gr
Natriumfosfat monobasiskt 0,32 gr
Slutliga tillägg för CDM
Kolinklorid 0,1 gr
L-cystein HCl 0.075 gr
Bikarbonat 0,25 gr

Tabell 4: Startlager och slutliga tillägg för CDM. Förkortning: CDM = kemiskt definierade medier.

Antikropp/fluorofor Klon Utspädningsfaktorn
L/D för UV-excitation Ej tillämpligt 0.38888889
Ly6G AF 488 1A8 0.25
CD11b APC M1/70 0.25
CD11c PE N418 0.18055556
Mus Fc Block 2.4G2 0.11111111
F4/80 PE Cy7 BM8 0.18055556
Ly6C BV605 AL-21 0.25
CD103 BV 421 M290 0.18055556
CD45 APC-eF-780 30-F11 0.18055556

Tabell 5: Antikroppspanel 1.

Antikropp/fluorofor Klon Utspädningsfaktorn
L/D för UV-excitation Ej tillämpligt 0.388888889
TCR-β APC Cy7 H57-597 0.180555556
CD4 V450 (Pacific Blå) RM4-5 0.25
CD8 BV650 53-6.7 0.180555556
Mus Fc Block 2.4G2 0.111111111
CD45 PE 30-F11 0.180555556
CD3 AF488 145-2C11 0.180555556
TCR- γΔ APC GL-3 0.180555556
NK1.1 AF 700 PK136 0.180555556

Tabell 6: Antikroppspanel 2.

Discussion

De flesta av de befintliga experimentella studierna av S. pneumoniae / IAV-saminfektion är beroende av bakteriell leverans i lungorna hos möss som är preinfekterade med IAV. Dessa modeller har hjälpt till att identifiera förändringar i lungmiljön och systemiskt immunsvar som gör värden mottaglig för sekundär bakteriell infektion 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Dessa modeller har emellertid misslyckats med att efterlikna övergången av S. pneumoniae från en asymptomatisk kolonisator till en patogen som kan orsaka allvarliga lung- och systemiska infektioner. Vidare är dessa modeller inte lämpliga för att studera värdfaktorer och värd-patogeninteraktioner i övre luftvägarna som bidrar till mottaglighet för infektion. En tidigare modell för förflyttning av pneumokocker från nasofarynx till lungan efter IAV-infektion förlitade sig på bakteriell infektion i nasofarynx följt av virusinfektion. Det misslyckades dock med att reproducera de allvarliga tecken på sjukdom som observerats hos mänskliga patienter21. Den modifierade murina infektionsmodellen som beskrivs här rekapitulerar övergången av S. pneumoniae från asymptomatisk vagn till en patogen som orsakar allvarlig klinisk sjukdom.

Ett kritiskt steg i denna modell är att etablera S. pneumoniae-infektion i nasofarynxen. Streptococcus pneumoniae bildar biofilmer och koloniserar nasofarynx vid olika effektivitet21,38. För att etablera konsekvent infektion krävs minst 5 × 106 CFU av de biofilmodlade bakteriestammar som hittills testats23. Det rekommenderas att alla nya bakteriestammar testas för stabil infektion i nasofarynx före virusinfektion. För viral saminfektion har tidigare studier funnit att intranasal infektion med IAV krävs för spridning av bakterierna från nasofarynx21,22,23. I dessa tidigare studier användes 500 PFU av IAV för intranasal leverans, medan i denna studie var 200 PFU tillräckliga för att öka bakterieantalet i nasofarynxen. IAV-infektion är inte begränsad till de övre luftvägarna och kan spridas till lungorna39,40, vilket är nyckeln till att göra lungmiljön mer tillåtande för bakteriell infektion15,16,41. Leverans av IAV till lungorna kan uppnås genom antingen intranasal leverans eller intratrakeal installation av bedövade möss. Tidigare arbete med BALB / cByJ-möss fann att intranasal leverans resulterar i viral lunginflammation21; inokulumets tillgång till lungorna efter intranasal inokulering är dock mer begränsad hos C57BL/6-möss. Hos möss med C57BL/6 krävs intratrakeal installation för konsekvent tillförsel av virus23. I denna modell accelererar tidigare bakteriekolonisering presentationen av sjukdomssymtom efter virusinfektion23. Eftersom virusinfektion i sig kan orsaka sjukdomssymtom med potentiell variation i kinetik, rekommenderas att man först testar en rad doser för alla nya virusstammar som testas och väljer en dos som avslöjar accelererad kinetik hos saminfekterade värdar.

Lungorna ger en annan kritisk avläsning för sjukdomsutvärdering i denna modell. För bedömning av patogenbörda och tillströmning av immunceller kan en lunga från samma mus användas. Men eftersom infektionens och inflammationens svårighetsgrad kan skilja sig åt mellan loberna, rekommenderas det att inte ta olika lober av samma lunga för de olika bedömningarna. Snarare kan alla loberna hackas i små bitar, blandas väl ihop och sedan analyseras lika för de olika bedömningarna. På liknande sätt kan nasofarynx användas för räkning av bakteriell CFU eller viral PFU och immunsvar. Antalet celler som erhålls från tvättar och vävnader är dock för lågt för att utföra flödescytometri utan att samla proverna från möss inom samma grupp. Alternativt kan inflammation i nasofarynx bedömas histologiskt23.

Ett kritiskt inslag i denna modell är att den rekapitulerar den kliniska sjukdomen som ses hos patienter. Hos människor resulterar sekundär pneumokockpneumoni efter IAV-infektion ofta i uppenbara tecken på sjukdom, inklusive hosta, dyspné, feber och muskelvärk som kan leda till sjukhusvistelser, andningssvikt och till och med död 8,15,42,43. Denna modell rekapitulerar de allvarliga tecken på klinisk sjukdom som observerats hos människor när det gäller andningssvårigheter (återspeglas i andningspoängen) och övergripande sjukdom (återspeglas i hållning och rörelsepoäng) som visas av mössen, liksom död hos några av de friska unga kontrollerna. De förvärrade sjukdomssymtomen hos saminfekterade möss är sannolikt ett resultat av både bakteriell spridning till lungorna och nedsatt virusclearance hos möss med pneumokock vagn23. En begränsning med modellen är att förekomsten av klinisk sjukdom och bakteriespridning från nasofarynx varierar mellan möss och påverkas av bakteriestam, värdålder och genotyp21,22,23. För invasiva stammar kan progressionen från lokaliserad infektion (utan detekterbar bakteriemi) till döden ske inom 24 timmar. För en sann bedömning av systemisk spridning bör därför bakteriemi följas med kortare intervall (var 6-12 h). På samma sätt kan sjukdomspoängen förändras snabbt, särskilt under de första 72 timmarna efter samtidig infektion. För att noggrant spåra sjukdomssymptomen är det därför lämpligt att övervaka möss tre gånger per dag i dag 1-3 efter IAV-infektion.

Sammanfattningsvis replikerar denna modell rörelsen av S. pneumoniae från en asymptomatisk kolonisator av nasofarynx till en patogen som kan orsaka lung- och systemisk sjukdom vid IAV-infektion. I denna modell utlöser IAV övergången av S. pneumoniae genom att modifiera bakteriebeteendet i nasofarynx, öka bakteriell spridning till lungan och förändra antibakteriell immunitet23. På samma sätt avtrubbar bakteriell vagn de antivirala immunsvaren och försämrar IAV-clearance från lungorna23. Detta gör denna modell idealisk för att analysera förändringar i immunsvar vid enstaka kontra polymikrobiella infektioner. Dessutom är sjukdomsförloppet efter samtidig infektion delvis beroende av stammen av pneumokocker som finns i nasofarynxen. Därför är modellen lämplig för att dissekera de bakteriella faktorer som krävs för asymtomatisk kolonisering kontra patogen övergång av S. pneumoniae. Slutligen reproducerar denna modell mottagligheten av åldrande för saminfektioner, och även om detta inte testades här, kan det enkelt användas för att bedöma effekterna av värdbakgrund på sjukdomsförloppet. Sammanfattningsvis ger separering av vagn och sjukdom i distinkta steg möjlighet att analysera de genetiska varianterna av både patogenerna och värden, vilket möjliggör detaljerad undersökning av interaktionerna mellan en viktig patobiont och värden i olika faser av sjukdomsprogression. Framöver kan denna modell användas för att skräddarsy behandlingsalternativ för utsatta värdar.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Nick Lenhard för den kritiska läsningen och redigeringen av detta manuskript. Vi vill också tacka Andrew Camilli och Anthony Campagnari för bakteriestammarna och Bruce Davidson för virusstammarna. Detta arbete stöddes av National Institute of Health Grant (R21AG071268-01) till J.L. och National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) till E.N.B.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminobenzoic acid  Fisher AAA1267318 Mix I stock
96-well round bottom plates Greiner Bio-One 650101
100 µm Filters Fisher 07-201-432
Adenine Fisher AC147440250 Mix I stock
Avicel Fisher 501785325 Microcyrstalline cellulose 
BD Cytofix Fixation Buffer  Fisher BDB554655 Fixation Buffer
BD Fortessa Flow cytometer 
BD Intramedic Polyethylene Tubing  Fisher 427410 Tubing for nasal lavage
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL) Fisher 14-823-30
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure Fisher 02-675-185 Blood collection tubes
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide Fisher AAJ6233703 Mix IV stock
Biotin Fisher AC230090010 Vitamin stock
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000644 Mice used in this study
Calcium Chloride Anhydrous Fisher Chemical C77-500 Mix I stock
CD103 BV 421 BD Bioscience BDB562771 Clone: M290 DF 1:200
CD11b APC Invitrogen 50-112-9622 Clone: M1/70, DF 1:300
CD11c PE BD Bioscience BDB565592 Clone: N418 DF 1:200
CD3 AF 488 BD Bioscience OB153030 Clone: 145-2C11 DF 1:200
CD4 V450 BD Horizon BDB560470 Clone: RM4.5 DF 1:300
CD45 APC eF-780 BD Bioscience 50-112-9642 Clone: 30-F11 DF 1:200
CD45 PE Invitrogen 50-103-70 Clone: 30-F11 DF 1:200
CD8α BV 650 BD Horizon BDB563234 Clone: 53-6.7 DF 1:200
Choline chloride Fisher AC110290500 Final supplement to CDM
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems Fisher 09-761-107 Filter sterilzation apparatus 
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks Fisher 10-126-9
Corning Costar Clear Multiple Well Plates Fisher 07-201-590
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate Fisher MT10017CM
Cyanocobalamin Fisher AC405925000 Mix I stock
D39 National Collection of Type Culture (NCTC) NCTC 7466 Streptococcus pneumoniae strain
D-Alanine Fisher AAA1023114 Mix I stock
D-Calcium pantothenate Fisher AC243301000 Vitamin stock
Dextrose Fisher Chemical D16-500 Starter stock
Dnase  Worthington Biochemical  LS002147
Eagles Minimum Essential Medium ATCC 30-2003
EDTA VWR BDH4616-500G
EF3030 Center for Disease Control and Prevention  Available via the isolate bank request Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name
F480 PE Cy7 BD Bioscience 50-112-9713 Clone: BMB DF 1:200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 50 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap Fisher 14-959-11B 15 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL) Fisher 14-959-5 FACS tubes 
FBS Thermofisher 10437-028
Ferric Nitrate Nonahydrate Fisher I110-100 Mix III stock
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors Fisher 08-951-5 Instruments used for harvest
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops  Fisher 22-363-602 Inoculating loops 
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps Fisher 13-812-38 Forceps for harvest
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher 05-408-137 Micocentrifuge tubes
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL) Fisher 14-955-459
Folic Acid Fisher AC216630500 Vitamin stock
Gibco RPMI 1640 (ATCC) Fisher A1049101
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium Fisher 14190250
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red Fisher 14025134
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red Fisher 11-935-046
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher 15-140-122
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher 15-250-061
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher 25-200-056
Glycerol (Certified ACS) Fisher G33-4
Glycine Fisher AA3643530 Amino acid stock
Guanine Fisher AAA1202414 Mix II stock
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads Fisher 50-112-9040
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher AAA1517836 Mix III stock
L-Alanine Fisher AAJ6027918 Amino acid stock
L-Arginine Fisher AAA1573814 Amino acid stock
L-Asparagine Fisher AAB2147322 Amino acid stock
L-Aspartic acid  Fisher AAA1352022 Amino acid stock
L-Cysteine Fisher AAA1043518 Amino acid stock
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Fisher AAA1038914 Final supplement to CDM
L-Cystine Fisher AAA1376218 Amino acid stock
L-Glutamic acid  Fisher AC156211000 Amino acid stock
L-Glutamine Fisher O2956-100 Amino acid stock
L-Histidine Fisher AC166150250 Amino acid stock
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Invitrogen 50-112-1524 Clone: N/A DF 1:500
L-Isoleucine Fisher AC166170250 Amino acid stock
L-Leucine Fisher BP385-100 Amino acid stock
L-Lysine Fisher AAJ6222514 Amino acid stock
L-Methionine Fisher AAA1031822 Amino acid stock
Low endotoxin BSA  Sigma Aldrich A1470-10G
L-Phenylalanine Fisher AAA1323814 Amino acid stock
L-Proline Fisher AAA1019922 Amino acid stock
L-Serine Fisher AC132660250 Amino acid stock
L-Threonine Fisher AC138930250 Amino acid stock
L-Tryptophan Fisher AAA1023014 Amino acid stock
L-Valine Fisher AAA1272014 Amino acid stock
Ly6C BV 605 BD Bioscience BDB563011 Clone: AL-21 DF 1:300
Ly6G AF 488  Biolegend NC1102120 Clone: IA8, DF 1:300
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells  American Type Culture Collection (ATCC) CCL-34 MDCK cell line for PFU analuysis 
Magnesium Sulfate 7-Hydrate Fisher 60-019-68 CDM starter stock
Manganese Sulfate Fisher M113-500 Mix I stock
MilQ water Ultra-pure water
Mouse Fc Block BD Bioscience BDB553142 Clone: 2.4G2 DF 1:100
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT Fisher NC1886507 Eye lubricant for infection
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line  ATCC CRL-1848 H292 lung epithelial cell line for biofilm growth
Niacinamide Fisher 18-604-792 Vitamin stock
NK 1.1 AF 700 BD Bioscience 50-112-4692 Clone: PK136 DF 1:200
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk Fisher 50-200-5299 To remove oxygen from liquid cultures
Paraformaldehyde 4% in PBS Thermoscientific J19932-K2
Pivetal Isoflurane  Patterson Veterinary 07-893-8440 Isoflurane for anesthesia during infection 
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Chemical P288-500 Starter stock
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Chemical P285-500 Starter stock
Pyridoxal hydrochloride  Fisher AC352710250 Vitamin stock
Pyridoxamine dihydrochloride Fisher AAJ6267906 Mix I stock
Riboflavin Fisher AC132350250 Vitamin stock
Sodium Acetate VWR 0530-500G Starter stock
Sodium Azide  Fisher Bioreagents BP922I-500 For FACS buffer
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-500 Starter stock and final supplement to CDM
Sodium Phosphate Dibasic Fisher Chemical S374-500 Starter stock
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Chemical S369-500 Starter stock
TCR APC  BD Bioscience 50-112-8889 Clone: GL-3 DF 1:200
TCRβ APC-Cy7 BD Pharmigen BDB560656 Clone: H57-597 DF 1:200
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin Fisher R01227 Blood agar plates with the antibiotic gentamicin 
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated Fisher PI20233
Thiamine hydrochloride Fisher AC148991000 Vitamin stock
TIGR4 ATCC BAA-334 Streptococcus pneumoniae strain
Uracil Fisher AC157300250 Mix II stock
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g Fisher NC9693955

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nature Reviews Microbiology. 6 (4), 288-301 (2008).
  2. Obaro, S., Adegbola, R. The pneumococcus: Carriage, disease and conjugate vaccines. Journal of Medical Microbiology. 51 (2), 98-104 (2002).
  3. Chong, C. P., Street, P. R. Pneumonia in the elderly: A review of the epidemiology, pathogenesis, microbiology, and clinical features. Southern Medical Journal. 101 (11), 1141-1145 (2008).
  4. Kadioglu, A., Andrew, P. W. Susceptibility and resistance to pneumococcal disease in mice. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 4 (3), 241-247 (2005).
  5. Ganie, F., et al. Structural, genetic, and serological elucidation of Streptococcus pneumoniae serogroup 24 serotypes: Discovery of a new serotype, 24C, with a variable capsule structure. Journal of Clinical Microbiology. 59 (7), 0054021 (2021).
  6. Centers for Disease Control and Prevention. Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
  7. Shrestha, S., et al. Identifying the interaction between influenza and pneumococcal pneumonia using incidence data. Science Translational Medicine. 5 (191), (2013).
  8. McCullers, J. A. Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 571-582 (2006).
  9. Pneumococcal Disease Global Pneumococcal Disease and Vaccine. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/pneumococcal/global.html (2018).
  10. Grudzinska, F. S., et al. Neutrophils in community-acquired pneumonia: Parallels in dysfunction at the extremes of age. Thorax. 75 (2), 164-171 (2020).
  11. Boe, D. M., Boule, L. A., Kovacs, E. J. Innate immune responses in the ageing lung. Clinical and Experimental Immunology. 187 (1), 16-25 (2017).
  12. Krone, C. L., van de Groep, K., Trzcinski, K., Sanders, E. A., Bogaert, D. Immunosenescence and pneumococcal disease: An imbalance in host-pathogen interactions. The Lancet Respiratory Medicine. 2 (2), 141-153 (2014).
  13. Cho, S. J., et al. Decreased NLRP3 inflammasome expression in aged lung may contribute to increased susceptibility to secondary Streptococcus pneumoniae infection. Experimental Gerontology. 105, 40-46 (2018).
  14. Disease Burden of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/flu/about/burden/index.html (2018).
  15. McCullers, J. A. The co-pathogenesis of influenza viruses with bacteria in the lung. Nature Reviews Microbiology. 12 (4), 252-262 (2014).
  16. McCullers, J. A., Rehg, J. E. Lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae: Characterization of a mouse model and the role of platelet-activating factor receptor. The Journal of Infectious Diseases. 186 (3), 341-350 (2002).
  17. Metzger, D. W., Sun, K. Immune dysfunction and bacterial coinfections following influenza. Journal of Immunology. 191 (5), 2047-2052 (2013).
  18. Chao, Y., Marks, L. R., Pettigrew, M. M., Hakansson, A. P. Streptococcus pneumoniae biofilm formation and dispersion during colonization and disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 194 (2014).
  19. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: The key to pneumococcal disease. The Lancet Infectious Diseases. 4 (3), 144-154 (2004).
  20. Simell, B., et al. The fundamental link between pneumococcal carriage and disease. Expert Review of Vaccines. 11 (7), 841-855 (2012).
  21. Marks, L. R., Davidson, B. A., Knight, P. R., Hakansson, A. P. Interkingdom signaling induces Streptococcus pneumoniae biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to disease. mBio. 4 (4), 00438 (2013).
  22. Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Sauberan, S. L., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Streptococcus pneumoniae modulates Staphylococcus aureus biofilm dispersion and the transition from colonization to invasive disease. mBio. 9 (1), 02089 (2018).
  23. Joma, B. H., et al. A murine model for enhancement of Streptococcus pneumoniae pathogenicity upon viral infection and advanced age. Infection and Immunity. 89 (8), 0047120 (2021).
  24. Andersson, B., et al. Identification of an active disaccharide unit of a glycoconjugate receptor for pneumococci attaching to human pharyngeal epithelial cells. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 559-570 (1983).
  25. Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. The Journal of Experimental Medicine. 79 (2), 137-158 (1944).
  26. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  27. Tothpal, A., Desobry, K., Joshi, S. S., Wyllie, A. L., Weinberger, D. M. Variation of growth characteristics of pneumococcus with environmental conditions. BMC Microbiology. 19 (1), 304 (2019).
  28. Bou Ghanem, E. N., et al. Extracellular adenosine protects against Streptococcus pneumoniae lung infection by regulating pulmonary neutrophil recruitment. PLoS Pathogens. 11 (8), 1005126 (2015).
  29. Bou Ghanem, E. N., et al. The alpha-tocopherol form of vitamin E boosts elastase activity of human PMNs and their ability to kill Streptococcus pneumoniae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 161 (2017).
  30. Tait, A. R., Davidson, B. A., Johnson, K. J., Remick, D. G., Knight, P. R. Halothane inhibits the intraalveolar recruitment of neutrophils, lymphocytes, and macrophages in response to influenza virus infection in mice. Anesthesia & Analgesia. 76 (5), 1106-1113 (1993).
  31. Aaberge, I. S., Eng, J., Lermark, G., Lovik, M. Virulence of Streptococcus pneumoniae in mice: A standardized method for preparation and frozen storage of the experimental bacterial inoculum. Microbial Pathogenesis. 18 (2), 141-152 (1995).
  32. McCullers, J. A., Bartmess, K. C. Role of neuraminidase in lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae. The Journal of Infectious Diseases. 187 (6), 1000-1009 (2003).
  33. Smith, A. M., McCullers, J. A. Secondary bacterial infections in influenza virus infection pathogenesis. Current Topics in Microbiology and Immunology. 385, 327-356 (2014).
  34. Cundell, D. R., Gerard, N. P., Gerard, C., Idanpaan-Heikkila, I., Tuomanen, E. I. Streptococcus pneumoniae anchor to activated human cells by the receptor for platelet-activating factor. Nature. 377 (6548), 435-438 (1995).
  35. Ballinger, M. N., Standiford, T. J. Postinfluenza bacterial pneumonia: Host defenses gone awry. Journal of Interferon & Cytokine Research. 30 (9), 643-652 (2010).
  36. Sun, K., Metzger, D. W. Inhibition of pulmonary antibacterial defense by interferon-gamma during recovery from influenza infection. Nature Medicine. 14 (5), 558-564 (2008).
  37. Nakamura, S., Davis, K. M., Weiser, J. N. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3657-3665 (2011).
  38. Blanchette-Cain, K., et al. Streptococcus pneumoniae biofilm formation is strain dependent, multifactorial, and associated with reduced invasiveness and immunoreactivity during colonization. mBio. 4 (5), 00745 (2013).
  39. Rello, J., Pop-Vicas, A. Clinical review: Primary influenza viral pneumonia. Critical Care. 13 (6), 235 (2009).
  40. Torres, A., Loeches, I. M., Sligl, W., Lee, N. Severe flu management: A point of view. Intensive Care Medicine. 46 (2), 153-162 (2020).
  41. Bakaletz, L. O. Viral-bacterial co-infections in the respiratory tract. Current Opinion in Microbiology. 35, 30-35 (2017).
  42. Palacios, G., et al. Streptococcus pneumoniae coinfection is correlated with the severity of H1N1 pandemic influenza. PLoS One. 4 (12), 8540 (2009).
  43. Dhanoa, A., Fang, N. C., Hassan, S. S., Kaniappan, P., Rajasekaram, G. Epidemiology and clinical characteristics of hospitalized patients with pandemic influenza A (H1N1) 2009 infections: The effects of bacterial coinfection. Virology Journal. 8, 501 (2011).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 187
En musmodell för övergången av <em>Streptococcus pneumoniae</em> från kolonisatör till patogen vid viral saminfektion rekapitulerar åldersförvärrad sjukdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lenhard, A., Joma, B. H.,… More

Lenhard, A., Joma, B. H., Siwapornchai, N., Hakansson, A. P., Leong, J. M., Bou Ghanem, E. N. A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness. J. Vis. Exp. (187), e64419, doi:10.3791/64419 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter