דיסקציה של צינור המרה החוץ-כבדי וכיס המרה בניודים של עכברים בני תשעה ימים
Summary
לתצפית על הפרעות בצינור המרה של מורין, נדרש צינור מרה שלם והכנה יעילה. לכן, גישה חדשה לבידוד כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים ביילודים מורין פותחה בהצלחה תוך שמירה על שלמות צינור המרה.
Abstract
כריתה של צינורות מרה ילודים מורין תוארה כקשה. המטרה העיקרית של הליך ההפעלה הסטנדרטי המתואר היא בידוד של צינור המרה החוץ-כבד (EBD) ביילודים של עכברים מבלי לפגוע בצינור המרה במהלך ההכנה. בגלל ההכנה הקרובה במיוחד שלה בהשוואה לקו התאים של כולנגיוציטים וקציר של כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים (EBDS), הגישה המתוארת שימושית ביותר בחקר מודלים של בעלי חיים של הפרעות בצינור המרה של יילודים, כגון אטרזיה של המרה. לאחר המתת חסד, חלל הצפק היה גישה, ואת מערכת צינור המרה, התריסריון, ואת הכבד חולצו עם הייחודי En-bloc-Reduct (EbR). הדגימה המופקת מונחת על מחצלת קצף, וה- EBD מנותח מתאים מזהמים באופן אטראומטי ללא מגע הכרחי. ניתוח של EBDS כולו הוא יתרון משמעותי של שיטה זו. יש לנקוט משנה זהירות בשל הגודל הקטן והכמות של רקמת צינור המרה. באמצעות הטכניקה המתוארת, אין נזק cholangiocytes. יתר על כן, טוהר הטכניקה ניתן לשחזור (n = 10). לכן, ניתן לקצור דגימות דומות באופן אופטימלי. יתר על כן, אף רקמת צינור המרה אינה נפגעת, מכיוון שניתן להימנע מכל מגע עם מערכת צינור המרה במהלך ההכנה, ולהשאיר את נוזל המרה בתוך כיס המרה. והכי חשוב, בעת ביצוע כיס המרה הסופי ודיסקציה של צינור המרה, מיקרו-מכשירים א-טראומטיים שימשו רק מעט לרוחב צינור המרה מבלי לסחוט אותו. זהו המפתח למדגם נקי ושלם, וחיוני לחקירה היסטולוגית נוספת או לבידוד של כולנגיוציטים. לסיכום, טכניקת הדיסקציה החדשנית המתוארת מאפשרת למפעילים חסרי ניסיון במיוחד עם הציוד הדרוש לבודד את ה- EBDS בצורה נקייה ככל האפשר.
Introduction
ההתחלה וההתקדמות של כולנגיופתיות כגון אטרזיה מרה, כולנגיטיס סקלרוזית ראשונית (PSC), וכולנגיטיס מרה ראשונית (PBC) אינן ידועות או לא שלמות 1,2. ההבנה המוגבלת של מקורן והתקדמותן של מחלות אלה מובילה למיעוט אפשרויות הטיפול3. המכשול הקשה ביותר בחקר הפרעות בצינור המרה של ילודים הוא השגת הבנה מולקולרית של הפתופיזיולוגיה. אחד המפתחות החיוניים להבנה טובה יותר של הפתולוגיה המולקולרית הוא התצפית הטובה ביותר האפשרית על רקמות מושפעות. כדי למנוע השוואה מופחתת ופערים בין מחקרים, כגון התבוננות באטיולוגיה ויראלית פוטנציאלית של אטרזיה מרה4, מתעורר הצורך בהכנה הטובה ביותר האפשרית ושיתוף של טכניקות הדיסקציה שבוצעו. הכנה טהורה של רקמת המטרה נחוצה למחקרים מיקרוסקופיים מאוחרים יותר או לגידול תרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות ותלת-ממדיות. עם זאת, בהפרעות ילודים מורין, דגימות רקמות הן נדירות ומתרחשות רק בכמות קטנה בשל גודל קטן מאוד. לגבי הפרעות בצינור המרה, תוארו קשיים בהכנה נקייה של צינורות המרה בילודים מורין5. בשל שלב ההתפתחות של היילודים, התמיינות הרקמות אינה מתקדמת יתר על המידה, מה שמסבך את ההכנה ומגביר את הקושי בהשוואה להכנת דגימות בוגרות. לכן, קבוצת העבודה התפעולית חקרה אסטרטגיה חדשנית להכנת ה- EBDS במודל עכבר יילודים. במחקר הנוכחי, הטכניקה מאפשרת ניתוח יעיל של כל דגימה.
מערכת צינור המרה ממוקמת באופן תוך-צפקי בבטן העליונה הימנית, הנובעת מהכבד. כיס המרה ממוקם מתחת לפני השטח הקרביים של האונה הימנית של הכבד. צינור המרה, יחד עם וריד הפורטל ועורק הכבד, מוטבע ברצועת ההפטודודנל. הוא מחבר את הכבד ואת התריסריון ישירות ומנקז נוזל מרה לתוך התריסריון6. מבחינה אנטומית, צינור המרה מחולק לצינורות הכבד הימניים והשמאליים, צינור הכבד המשותף, הצינור הציסטי, ודוקטוס choledochus, אשר נוצר על ידי מפגש של צינור ציסטי ואת צינור הכבד המשותף7. זה בסופו של דבר מרוקן נוזל מרה ורוק מצינור הלבלב לתוך התריסריון דרך אמפולה של Vater.
כולנגיוציטים מרפדים את צינור המרה באופן תוך-הפטי וחוץ-הפטי, ושוכנים בנישה אנטומית מסובכת שבה הם מסייעים בייצור מרה ובהומאוסטזיס8. נוזל המרה עובר את תאי האפיתל המתמחים האלה בריכוזים גבוהים מדי יום. בפרט, תחזוקת מטריית HCO3 חשובה מאוד להגנה מפני רעילות חומצת מרה9. Cholangiocytes הם קו ההגנה הראשון במערכת hepatobiliary נגד, למשל, מיקרואורגניזמים luminal10. יעילות ההגנה של כולנגיוציטים מפני התקפות רעילות עלולה להיחלש על ידי נטייה גנטית. עומס יתר רעיל גורם לנזק והרס ולכן יכול להוביל לכולנגיופתיות. יתר על כן, צינור המרה המתפתח אינו מסוגל לחלוטין לכל מנגנוני ההגנה העצמית, מה שמוביל לרגישות גבוהה יותר לרעלנים סביבתיים בצינורות המרה היילודים11.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה דיווח ודן ביצירה ואימות של גישה כירורגית חדשה להסרת EBDS של עכברי ילודים מורדמים. ממצאים מיקרוסקופיים והיסטולוגיים מגלים כי הגישה מזהה במהירות EBDs ומנתחת אותם בסמוך לשולי הצינור, אפילו בעכברים ילודים. רק כלי ניתוח ומיקרוסקופ עם הגדלה של 20x נדרשים לפרוטוקול המתואר. יתר על כן, הגישה מאפ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ליוהנה האגנס, פאולין שופרט, קלרה פיליפי, PD ד”ר כריסטיאן טומושאט, סווניה וורנקה, PD ד”ר דיאנה לינדנר, פרופ’ ד”ר דירק וסטרמן, מרים טומצ’אק, ניקול לודר, נדין קורזאווה, ד”ר לאיה פייג’רולס רלוי, בירגיט אפל ומגדלנה טרוצ’ימיוק על תרומתם. הנס כריסטיאן שמידט נתמך כספית על ידי מלגת iPRIME של קרן אלזה קרנר פרסניוס (2021_EKPK.10), UKE, המבורג.
Materials
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the ‘biliary HCO3- umbrella’: an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
