Summary

9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리

Published: August 23, 2022
doi:

Summary

쥐 신생아 담관 장애를 관찰하려면 손상되지 않은 담관과 효율적인 준비가 필요합니다. 따라서 쥐 신생아에서 전체 간외 담관 시스템을 분리하기위한 새로운 접근법이 담관의 완전성을 유지하면서 성공적으로 개발되었습니다.

Abstract

쥐 신생아 담관의 해부는 어려운 것으로 묘사되었습니다. 설명 된 표준 수술 절차의 주요 목적은 준비 중에 담관을 손상시키지 않고 마우스 신생아에서 간외 담관 (EBD)을 분리하는 것입니다. 담관 세포 세포주와 비교하여 예외적으로 가까운 준비 및 전체 간외 담관 시스템 (EBDS)의 수확으로 인해 설명 된 접근법은 담도 폐쇄증과 같은 신생아 담관 장애의 동물 모델을 연구하는 데 매우 유용합니다. 안락사 후 복강에 접근하고 담관 시스템, 십이지장 및 간을 독특한 En-bloc-Reclause (EbR)로 추출했습니다. 추출된 샘플을 폼 매트 위에 놓고 EBD를 오염된 세포에서 해부하여 필요한 접촉 없이 외상으로 제거합니다. 전체 EBDS의 해부는이 방법의 중요한 이점입니다. 담관 조직의 크기와 양이 작기 때문에주의를 기울여야합니다. 설명 된 기술을 사용하면 담관 세포에 손상이 없습니다. 또한, 기술의 순도는 재현 가능하다 (n = 10). 따라서 최적으로 비교 가능한 샘플을 수확 할 수 있습니다. 또한 담관 조직에는 담즙 조직이 손상되지 않는데, 이는 준비 중에 담관 시스템과의 접촉을 피할 수 있기 때문에 담낭 내부에 담액이 남습니다. 가장 중요한 것은 최종 담낭 및 담관 박리를 수행하는 동안 외상성 미세 도구를 압박하지 않고 담관의 약간 측면에서만 사용했습니다. 이것은 깨끗하고 손상되지 않은 샘플의 핵심이며 추가 조직 학적 조사 또는 담관 세포의 분리에 필수적입니다. 요약하자면, 설명된 혁신적인 해부 기술을 통해 필요한 장비를 갖춘 특히 경험이 없는 작업자가 EBDS를 가능한 한 깨끗하게 격리할 수 있습니다.

Introduction

담도 폐쇄증, 원발성 경화성 담관염(PSC) 및 원발성 담즙성 담관염(PBC)과 같은 담관병증의 기원과 진행은 알려지지않았거나 불완전합니다1,2. 이러한 질병의 기원과 진행에 대한 제한된 이해는 치료 옵션의 부족으로 이어집니다3. 신생아 담관 장애를 연구하는 데 가장 어려운 장애물은 병태생리학에 대한 분자적 이해를 얻는 것입니다. 분자 병리학을 더 잘 이해하기 위한 필수 열쇠 중 하나는 영향을 받은 조직을 최대한 관찰하는 것입니다. 담도 폐쇄증4의 잠재적 인 바이러스 병인을 관찰하는 것과 같은 연구 간의 비교 가능성 및 불일치 감소를 피하기 위해, 수행 된 해부 기술의 최상의 준비 및 공유가 필요합니다. 표적 조직의 순수한 준비는 나중에 현미경 조사 또는 세포 및 3D 오가노이드 배양 육종에 필요합니다. 그러나 쥐 신생아 장애에서 조직 샘플은 드물고 크기가 매우 작기 때문에 소량 만 발생합니다. 담관 장애와 관련하여 쥐 신생아에서 담관을 깨끗하게 준비하는 데 어려움이 설명되었습니다5. 신생아 발달 단계로 인해 조직 분화가 지나치게 진행되지 않아 성인 샘플 준비에 비해 준비가 복잡해지고 어려움이 증가합니다. 따라서 운영 작업 그룹은 신생아 마우스 모델에서 EBDS를 준비하기 위한 새로운 전략을 조사했습니다. 본 연구에서이 기술은 효율적입니다각 샘플의 해부.

담관 시스템은 간에서 발생하는 오른쪽 상복부에 복강 내 배치됩니다. 담낭은 간 우엽의 내장 표면 아래에 있습니다. 담관은 문맥 및 간동맥과 함께 간십이지장 인대에 내장되어 있습니다. 간과 십이지장을 직접 연결하고 담즙액을 십이지장6으로 배출합니다. 해부학 적으로 담관은 오른쪽 및 왼쪽 간관, 총 간관, 낭성 관 및 낭성 관과 총 간관의 합류에 의해 형성되는 담관7로 나뉩니다. 이것은 결국 담액과 타액을 췌관에서 Vater의 팽대부를 통해 십이지장으로 비웁니다.

담관 세포는 담관 내 및 간외로 늘어서 있으며 담즙 생성과 항상성을 돕는 복잡한 해부학 적 틈새에 거주합니다8. 담액은 이러한 특수 상피 세포를 매일 고농도로 통과합니다. 특히, HCO3-우산 유지는 담즙산 독성으로부터 보호하기 위해 매우중요하다9. 담관 세포는 예를 들어 내강 미생물10에 대한 간 담도계의 첫 번째 방어선입니다. 독성 공격에 대한 담관 세포의 방어 효능은 유전 적 소인에 의해 약화 될 수 있습니다. 독성 과부하는 손상과 파괴를 유발하므로 담관 병증을 유발할 수 있습니다. 더욱이, 발달중인 담관은 모든 자기 보호 메커니즘을 완전히 할 수 없으며, 신생아 담관11에서 환경 독소에 대한 더 높은 감수성을 유도합니다.

Protocol

윤리적 승인(N045/2021)에 따라 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스 신생아를 9일령까지 관찰했습니다. 동물들은 독일 함부르크의 함부르크-에펜도르프 대학 의료 센터의 동물 시설에서 실험 목적으로 태어나 제공되었습니다. 신생아는 부모 동물과 함께 새장에 수용되었습니다. 환경 조건은 온도 (20-24 ° C), 12:12 h 명암 사이클 및 40 % -70 %의 상대 습도로 제어되었습니다. 1. 실험 준비</…

Representative Results

도 1A 는 뮤린 신생아의 EBDS를 보여주며, 이는 기술된 기술로 해부되었다. 현미경으로 볼 때 더 이상 간 조직이 보이지 않습니다. 간 조직은 프로토콜의 최종 분리 단계에서 제거되었으며 색상 및 일관성과 관련하여 담관 조직과 쉽게 구별 될 수 있습니다. 그림 1B 는 밀리미터 스케일과 비교하여 분리된 샘플을 보여줍니다. EBD의 길이(담낭에서 십이지장 …

Discussion

이 기사는 안락사된 신생아 마우스의 EBDS를 제거하기 위한 새로운 외과적 접근법의 생성 및 검증을 보고하고 논의했습니다. 현미경 및 조직학적 결과는 이 접근법이 EBD를 신속하게 감지하고 신생아 마우스에서도 덕트 가장자리 근처에서 해부한다는 것을 보여줍니다. 설명 된 프로토콜에는 수술 도구와 20 배 배율의 현미경 만 필요합니다. 또한 이 접근 방식을 통해 전체 EBDS를 격리할 수 있습니다….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl 및 Magdalena Trochimiuk의 공헌을 인정합니다. Hans Christian Schmidt는 함부르크의 UKE에 있는 Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME 장학금(2021_EKPK.10)의 재정 지원을 받았습니다.

Materials

2-Propanol CHEMSOLUTE 11365000 used as a dehydrating agent
30 G canula B Braun/Sterican, Melsungen Germany 4656300 canula for hydration of the sample
Air vent C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany Tec-Ononmic AZ 1200 the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun B Braun, Melsungen, Germany 2351744 saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland FD253R straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”  Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom EVC131A optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany 12612613 used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge  Carl Roth, Karlsruhe, Germany TT56.1 sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany 17990
Eosin MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany 41-6660-00 staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut FST, Heidelberg Germany 14959-09 Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps FST, Heidelberg Germany 11051-10 Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany 41-5130-00 staining solution, ready to use
Highresolotion microscope Vision Engineering, Send United Kingdom EVO503  Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used 
Microscope Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany BX60F5
Microscope Cover Glases Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 101244 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany 03-0060
Microtome Leica, Nußloch, Germany SM2010R Tool for sectioning (2 µm-slices) 
Omnifix-F 1 mL syringe B Braun, Melsungen, Germany 9161406V syringe without canula
Paraffin Sakura Finetec, Torrance, USA 4511 Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany TES 99 The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA) Morphisto 1176201000 Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 
Small Microsurgical Forceps  EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany (00)165 Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler Agntho's AB, Lidingö, Sweden 30085-15 150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation FST, Heidelberg Germany 14001-14 Device for decapitation
Warming cabinet Haraeus, Hanau, Germany T 6060 the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides

References

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Cite This Article
Schmidt, H. C., Hagens, J., Schuppert, P., Philippi, C., Reinshagen, K., Tomuschat, C. Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates. J. Vis. Exp. (186), e64424, doi:10.3791/64424 (2022).

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