नौ दिन पुराने माउस नवजात शिशुओं में एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली और पित्ताशय विच्छेदन
Summary
मुराइन नवजात पित्त नली विकारों के अवलोकन के लिए, एक बरकरार पित्त नली और कुशल तैयारी की आवश्यकता होती है। इसलिए, पित्त नली की अखंडता को बनाए रखते हुए मुराइन नवजात शिशुओं में पूरे एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली प्रणाली को अलग करने के लिए एक नया दृष्टिकोण सफलतापूर्वक विकसित किया गया था।
Abstract
मुराइन नवजात पित्त नलिकाओं के विच्छेदन को कठिन के रूप में वर्णित किया गया है। वर्णित मानक संचालन प्रक्रिया का मुख्य उद्देश्य तैयारी के दौरान पित्त नली को नुकसान पहुंचाए बिना माउस नवजात शिशुओं में एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली (ईबीडी) का अलगाव है। कोलेंजियोसाइट्स सेल लाइन और पूरे एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली प्रणाली (ईबीडीएस) की कटाई की तुलना में इसकी असाधारण रूप से करीबी तैयारी के कारण, वर्णित दृष्टिकोण नवजात पित्त नली विकारों के पशु मॉडल पर शोध करने में बेहद उपयोगी है, जैसे कि पित्त एट्रेसिया। इच्छामृत्यु के बाद, पेरिटोनियल गुहा तक पहुंच बनाई गई थी, और पित्त नली प्रणाली, ग्रहणी और यकृत को अद्वितीय एन-ब्लॉक-रिसेक्शन (ईबीआर) के साथ निकाला गया था। निकाले गए नमूने को फोम मैट पर रखा जाता है, और ईबीडी को आवश्यक स्पर्श के बिना दर्दनाक रूप से दूषित कोशिकाओं से विच्छेदित किया जाता है। पूरे ईबीडीएस का विच्छेदन इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ है। पित्त नली ऊतक के छोटे आकार और मात्रा के कारण सावधानी बरतनी चाहिए। वर्णित तकनीक का उपयोग करके, कोलेंजियोसाइट्स को कोई नुकसान नहीं होता है। इसके अलावा, तकनीक की शुद्धता प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (एन = 10)। इसलिए, बेहतर रूप से तुलनीय नमूने काटे जा सकते हैं। इसके अलावा, पित्त नली ऊतक को कोई नुकसान नहीं पहुंचाया जाता है, क्योंकि पित्त नली प्रणाली के साथ किसी भी संपर्क को तैयारी के दौरान टाला जा सकता है, पित्ताशय के अंदर पित्त द्रव छोड़ दिया जाता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, अंतिम पित्ताशय और पित्त नली विच्छेदन करते समय, इसे निचोड़ने के बिना पित्त नली के केवल थोड़े पार्श्व में दर्दनाक सूक्ष्म उपकरणों का उपयोग किया गया था। यह एक साफ और बरकरार नमूने की कुंजी है, और आगे हिस्टोलॉजिकल जांच या कोलेंजियोसाइट्स के अलगाव के लिए आवश्यक है। संक्षेप में, वर्णित अभिनव विच्छेदन तकनीक विशेष रूप से अनुभवहीन ऑपरेटरों को ईबीडीएस को यथासंभव सफाई से अलग करने के लिए आवश्यक उपकरणों के साथ सक्षम बनाती है।
Introduction
पित्त एट्रेसिया, प्राथमिक स्क्लेरोसिंग चोलैंगिटिस (पीएससी), और प्राथमिक पित्त चोलैंगिटिस (पीबीसी) जैसे कोलेंजियोपैथियों की उत्पत्ति और प्रगति या तो अज्ञात या अपूर्ण हैं। उन बीमारियों की उत्पत्ति और प्रगति की सीमित समझ चिकित्सा विकल्पों की कमी की ओरले जाती है। नवजात पित्त नली विकारों का अध्ययन करने में सबसे कठिन बाधा पैथोफिज़ियोलॉजी की आणविक समझ प्राप्त कर रही है। आणविक विकृति की बेहतर समझ के लिए आवश्यक कुंजी में से एक प्रभावित ऊतक का सबसे अच्छा संभव अवलोकन है। अनुसंधान के बीच कम तुलनात्मकता और विसंगतियों से बचने के लिए, जैसे कि बाइलरी एट्रेसिया4 के संभावित वायरल एटियलजि का अवलोकन करना, प्रदर्शन विच्छेदन तकनीकों की सर्वोत्तम संभव तैयारी और साझाकरण की आवश्यकता उत्पन्न होती है। लक्ष्य ऊतक की एक शुद्ध तैयारी बाद में सूक्ष्म जांच या प्रजनन सेल- और 3 डी-ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए आवश्यक है। हालांकि, मुराइन नवजात विकारों में, ऊतक के नमूने दुर्लभ होते हैं और बहुत छोटे आकार के कारण केवल थोड़ी मात्रा में होते हैं। पित्त नली विकारों के बारे में, मुराइन नवजात शिशुओं में पित्त नलिकाओं की साफ तैयारी में कठिनाइयोंका वर्णन किया गया है। विकास के नवजात चरण के कारण, ऊतक भेदभाव अत्यधिक उन्नत नहीं होता है, जो तैयारी को जटिल बनाता है और वयस्क नमूनों की तैयारी की तुलना में कठिनाई को बढ़ाता है। इसलिए, ऑपरेटिंग वर्कग्रुप ने नवजात माउस मॉडल में ईबीडीएस तैयार करने के लिए एक नई रणनीति की जांच की। वर्तमान अध्ययन में, तकनीक प्रत्येक नमूने के एक कुशल विच्छेदन की अनुमति देती है।
पित्त नली प्रणाली को यकृत से उत्पन्न होने वाले दाहिने ऊपरी पेट में इंट्रापेरिटोनियल रूप से रखा जाता है। पित्ताशय यकृत के दाहिने लोब की आंत की सतह के नीचे स्थित होता है। पित्त नली, पोर्टल नस और यकृत धमनी के साथ, हेपेटोडोडेनल लिगामेंट में एम्बेडेड है। यह यकृत और ग्रहणी को सीधे जोड़ता है और ग्रहणी 6 में पित्त द्रव को बाहरनिकालता है। शारीरिक रूप से, पित्त नली को दाएं और बाएं यकृत नलिकाओं, सामान्य यकृत नलिका, सिस्टिक वाहिनी और डक्टस कोलेडोचस में विभाजित किया जाता है, जो सिस्टिक वाहिनी और सामान्य यकृत वाहिनी7 के संगम से बनता है। यह अंततः पित्त द्रव और लार को अग्नाशयी नलिका से डुओडेनम में खाली कर देता है।
कोलेंजियोसाइट्स पित्त नली को इंट्रा- और एक्स्ट्राहेपेटिक रूप से पंक्तिबद्ध करते हैं, जो एक जटिल शारीरिक आला में रहते हैं जहां वे पित्त उत्पादन और होमियोस्टेसिस8 में सहायता करते हैं। पित्त द्रव इन विशेष उपकला कोशिकाओं को दैनिक उच्च सांद्रता में पारित करता है। विशेष रूप से, पित्त एसिड विषाक्ततासे बचाने के लिए एचसीओ 3- छाता रखरखाव बहुत महत्वपूर्ण है। कोलेंजियोसाइट्स हेपेटोबिलरी सिस्टम में रक्षा की पहली पंक्ति है, उदाहरण के लिए, ल्यूमिनल सूक्ष्मजीव10। विषाक्त हमलों के खिलाफ कोलेंजियोसाइट्स की रक्षा प्रभावकारिता आनुवंशिक प्रवृत्ति से कमजोर हो सकती है। एक विषाक्त अधिभार क्षति और विनाश का कारण बनता है और इसलिए कोलेंजियोपैथी का कारण बन सकता है। इसके अलावा, विकासशील पित्त नली सभी आत्म-सुरक्षात्मक तंत्रों में पूरी तरह से सक्षम नहीं है, जिससे नवजात पित्तनलिकाओं में पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थों के लिए उच्च संवेदनशीलता होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख ने इच्छामृत्यु नवजात चूहों के ईबीडीएस को हटाने के लिए एक नए सर्जिकल दृष्टिकोण के निर्माण और सत्यापन की सूचना दी और चर्चा की। माइक्रोस्कोपिक और हिस्टोलॉजिकल निष्कर्षों से पता चलता है कि दृष्टि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने जोहाना हेगन्स, पॉलीन शूपर्ट, क्लारा फिलिपी, पीडी डॉ मेड क्रिश्चियन टॉमसचैट, स्वेन्जा वार्नके, पीडी डॉ डायना लिंडनर, प्रोफेसर डॉ डिर्क वेस्टरमैन, मिरियम टॉमकज़क, निकोल लुडर, नादिन कुर्ज़ावा, डॉ। हंस क्रिश्चियन श्मिट को एल्स क्रोनर-फ्रेसेनियस-स्टिफटंग आईप्रिम छात्रवृत्ति (2021_EKPK.10), यूकेई, हैम्बर्ग द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।
Materials
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
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