Imagerie par autofluorescence pour évaluer la physiologie des algues rouges
Summary
Le présent protocole décrit l’imagerie par autofluorescence étape par étape et l’évaluation des changements phycobiliprotéiques dans les algues rouges sur la base d’une analyse spectrale. Il s’agit d’une méthode non marquée et non destructive pour évaluer l’adaptation cellulaire à des habitats extrêmes, lorsque seul du matériel rare est disponible et que les cellules se développent lentement, voire pas du tout, dans des conditions de laboratoire.
Abstract
Les algues rouges (Rhodophyta) contiennent des phycobiliprotéines et colonisent les habitats avec une faible lumière, mais certaines (par exemple, certaines espèces de Chroothece ) peuvent également se développer en plein soleil. La plupart des rhodophytes sont rouges, mais certains peuvent apparaître bleutés, selon la proportion de biliprotéines bleues et rouges (phycocyanine et phycoérythrine). Différentes phycobiliprotéines peuvent capturer la lumière à différentes longueurs d’onde et la transmettre à la chlorophylle a, ce qui rend possible la photosynthèse dans des conditions lumineuses très différentes. Ces pigments réagissent aux changements de l’habitat dans la lumière, et leur autofluorescence peut aider à étudier les processus biologiques. En utilisant Chroothece mobilis comme organisme modèle et le mode spectral lambda scan dans un microscope confocal, l’adaptation des pigments photosynthétiques à différentes lumières monochromatiques a été étudiée au niveau cellulaire pour deviner les conditions de croissance optimales de l’espèce. Les résultats ont montré que, même lorsque la souche étudiée était isolée d’une grotte, elle s’adaptait à des intensités lumineuses faibles et moyennes. La méthode présentée est particulièrement utile pour étudier les organismes photosynthétiques qui ne se développent pas ou se développent très lentement dans des conditions de laboratoire, ce qui est généralement le cas pour ceux qui vivent dans des habitats extrêmes.
Introduction
Les algues rouges, comme le genre Chroothece, peuvent pousser dans des habitats extrêmes, où elles doivent souvent faire face à des changements environnementaux marqués1. Les inondations et les sécheresses sont fréquentes dans les régions semi-arides où ce genre peut être trouvé, et certaines espèces ont été signalées dans les ruisseaux, les falaises, les grottes, ou même les eaux thermales2. Cependant, la plupart du temps, des variables biologiques, telles que la compétition ou le pâturage, relèguent les espèces à des conditions non optimales pour leur croissance. Comme ces organismes sont souvent difficiles à cultiver et qu’ils ne se développent pas ou se développent très lentement dans des conditions de laboratoire, une limitation majeure est la taille de l’échantillon disponible. Par conséquent, il est très important de suivre des méthodes non destructives ou des méthodes qui impliquent une manipulation minimale des échantillons 3,4.
Les compétences physiologiques nécessaires pour survivre dans ces environnements difficiles peuvent être surveillées en suivant les changements dans leurs systèmes photosynthétiques. Les mécanismes métaboliques, l’efficacité photosynthétique et la sensibilité à la lumière ou aux conditions de culture peuvent être révélés par les profils d’émission de fluorescence pigmentaire, en raison de changements précis dans leur transfert d’énergie ou piégeage 5,6,7,8.
L’autofluorescence des composés cellulaires peut être utilisée comme marqueur pour le cytodiagnostic ou comme indicateur naturel de l’état cellulaire ou du métabolisme en réponse à des signaux externes et internes par des changements dans l’émission9. Il peut également être utilisé pour discriminer taxonomiquement différents groupes d’organismes photosynthétiques10. Selon la position phylogénétique des microorganismes phototrophes, on peut trouver différentes caractéristiques de fluorescence in vivo. Par conséquent, une identification taxonomique basée sur les caractéristiques in vivo de la fluorescence phototrophique (y compris les spectres d’absorption et d’émission de fluorescence) a été tentée à plusieurs reprises11,12. En raison de la diversité des pigments accessoires parmi les taxons de phytoplancton, les différences dans les longueurs d’onde auxquelles la fluorescence de la chlorophylle a (Chl a) est stimulée, ou les différences dans les spectres d’émission, peuvent être utilisées pour déduire la taxonomie13. L’excitation de fluorescence in vivo et les spectres d’émission de ces spécimens reposent non seulement sur les phylums des algues, mais aussi sur l’adaptation du photosystème14. L’efficacité du transfert d’énergie à Chl a, ou le rapport de Chl a aux pigments accessoires, et la teneur en pigments cellulaires sont sensibles aux conditions de croissance5.
Les algues rouges, en particulier Chroothece, ont plusieurs pigments fluorescents accessoires – phycobiliprotéines et caroténoïdes; Les premiers se concentrent dans des phycobilisomes attachés aux thylakoïdes des chloroplastes. Les phycobiliprotéines (phycocyanine, phycoérythrine et allophycocyanine) peuvent capter la lumière à différentes longueurs d’onde et la transmettre à Chl a, ce qui rend possible la photosynthèse dans des conditions de lumière et de culture très différentes15. Par exemple, les espèces de Chroothece peuvent pousser à l’intérieur des grottes ou presque émerger dans des cours d’eau calcaires légèrement salins2.
Les lumières monochromatiques affectent la croissance et la composition pigmentaire des organismes photosynthétiques et ont été étudiées pour prévenir ou contrôler la croissance des organismes photosynthétiques dans les grottes. Mulec et al. ont montré que l’éclairage enrichi en rouge favorise la croissance des cyanobactéries, des algues et des plantes16. Des études antérieures ont également rapporté que la lumière verte affecte la composition pigmentaire des cyanobactéries17, tandis que d’autres ont révélé que la lumière verte empêche la croissance de la plupart des organismes photosynthétiques et que certaines cyanobactéries présentent une réduction des thylakoïdes et une intensité de fluorescence moyenneplus faible 18.
Pour comprendre la capacité de Chroothece en tant qu’organisme modèle à surmonter des conditions difficiles, des cellules en culture ont été exposées à des intensités lumineuses croissantes et à une lumière monochromatique (verte ou rouge)15, pour voir comment elle fait face aux conditions sombres des grottes (où la lumière rouge prédomine). Le protocole présenté ici reproduit l’effet des variables susmentionnées sur les phycobiliprotéines de Chroothece au niveau cellulaire en utilisant sa propre autofluorescence.
De nos jours, la fluorescence est couramment utilisée comme outil pour étudier les réponses physiologiques des plantes vasculaires, des microalgues, des macroalgues et des cyanobactéries13,14,16. La microscopie confocale spectrale à fluorescence est un excellent outil pour les études in vivo visant à évaluer la physiologie des échantillons photosynthétiques au niveau de la cellule unique 10,17,18,19,20, en évitant les problèmes liés au faible taux de croissance en laboratoire et les difficultés à obtenir suffisamment de biomasse pour les méthodes d’extraction et biochimiques associées8 . Une fois que les cellules sont traitées dans différentes conditions de culture pendant 2 semaines, le profil de scintigraphie lambda peut être mesuré in vivo. Bien qu’il existe plusieurs publications dans lesquelles différentes longueurs d’onde d’excitation par imagerie confocale ont été utilisées 3,4,10,17, la plupart des phycobiliprotéines et Chl a peuvent être détectées à l’aide d’une raie d’excitation de longueur d’onde de 561 nm, et l’émission détectée varie de 570 à 760 nm de longueur d’onde. Ces critères ont été basés sur une analyse préalablement réalisée10 avec des pigments purs commerciaux (Tableau 1) par imagerie confocale et les résultats obtenus chez différentes espèces d’algues20,21,22.
| Pigments | λFLMAX (nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11,2 ± 0,2 | 1,8 ± 0,05 | 2,0 ± 0,08 | 12,2 ± 0,7 | 6,0 ± 0,3 | 4,2 ± 0,16 | 80,7 ± 1,5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5,9 ± 0,6 | 5,9 ± 0,16 | 11,1 ± 0,04 | 42,2 ± 0,3 | 100,0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99,2 ± 0,08 | – |
| 652.1-668.6 | – | – | 1,5 ± 0,01 | 3,7 ± 0,04 | 26,7 ± 0,5 | 8,7 ± 0,16 | 11,1 ± 0,16 | 11,3 ± 0,2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2,3 ± 0,04 | 1,0 ± 0,01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2,0 ± 0,08 | 2,0 ± 0,04 | 3,3 ± 0,16 | 33,6 ± 0,9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15,1 ± 1,5 | 9,6 ± 0,98 | 1,0 ± 0,04 | 1,2 ± 0,08 | 5,9 ± 0,7 | 4,1 ± 0,5 | 23,2 ± 3,5 | 91,4 ± 2,3 |
Tableau 1 : informations sur les pigments purs utilisées pour exécuter l’analyse lambda. Ce tableau montre les pics d’émission et les maxima épaules/bande de fluorescence de différents fluorochromes/pigments par spectrophotométrie d’imagerie confocale pour toutes les longueurs d’onde d’excitation, et le pourcentage d’émission lumineuse par les pigments/fluorochromes. Les valeurs ont été calculées par la formule: = MFI*100/255. Chaque valeur est la moyenne ± SE (moyenne ± erreur-type par rapport à la moyenne). Des pigments purs ont été utilisés pour étalonner le microscope laser à balayage confocale comme suit 1,2,10. La chlorophylle a a été obtenue à partir de Spinacia oleracea, la R-phycoérythrine (R-PE) de Porphyra tenera et la C-phycocyanine (C-PE) à partir de Spirulina sp. Toutes les espèces ont été dissoutes dans de l’eau distillée filtrée. L’allophycocyanine-XL (APC-XL) a été obtenue à partir de Mastigocladus laminosus, qui a été dissous dans du sulfate d’ammonium (60%) et du phosphate de potassium (pH = 7) pour atteindre une concentration de 38 mM. Les scans ont été effectués avec 400 μL de chaque solution pigmentaire (concentration de 1 mg/mL) en utilisant une chambre de fond en verre recouverte de 8 puits.
L’étude d’une seule longueur d’onde d’excitation est une première approximation très utile. Dans ce cas, cependant, il est nécessaire d’élucider la contribution relative des différents complexes dans le signal de fluorescence, ce qui est recommandé pour effectuer un rapport de fluorescence ou une analyse du spectre à plusieurs longueurs d’onde, entre autres méthodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Certaines algues rouges unicellulaires ou coloniales, telles que Chroothece, poussent lentement in vitro, mais contiennent plusieurs composés autofluorescents qui peuvent être analysés par analyse spectrale au microscope confocal, où les différences dans les pics d’émission pigmentaire peuvent être détectées. La microscopie confocale spectrale à fluorescence nous a permis de mener des études in vivo pour évaluer l’adaptation ou l’acclimatation des organismes photosynthétiques…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été réalisée dans le cadre des projets TIN2015-68454-R et 20961/PI/18, financés par le ministère espagnol de l’Économie et de la Compétitivité et la Fondation Séneca de la région de Murcie. Irene Hernández Martínez et Francisco Javier Ibáñez López de la Section de soutien statistique du domaine scientifique et de la recherche de l’Université de Murcie (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Figure 1 ont été dessinés à l’aide d’images de Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier est sous licence Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
| red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | – | – |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
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